二氮嗪对缺血再灌注大鼠心肌内皮细胞的保护作用

二氮嗪对缺血再灌注大鼠心肌内皮细胞的保护作用

缺血性再灌注损伤是影响心脏直隶手术后顺利恢复的重要原因之一。心肌内皮细胞的结构和功能损伤是缺血性再灌注损伤病理生理过程的基础之一。在颅内系统损伤后，由于-1（icam-1），肿瘤坏死因子（tnf）和内皮素（ediol，et）和氧化氮（no）等血管活性物质的变化对心肌损伤过程中起着重要作用。近年来研究证明,心肌线粒体ATP敏感性钾通道(MitoKATP)是心肌缺血再灌注损伤的重要治疗靶点。二氮嗪(dazoxide,DZ)是MitoKATP开放剂,具有对缺血再灌注心肌的保护作用。本研究采用体外大鼠心肌Langendorff灌注模型,观察了DZ对心肌内皮细胞结构与功能的影响,探讨其心肌保护作用及机制。1材料和方法1.1实验动物健康成年大鼠50只,雌雄不限,由大坪医院实验动物中心提供。1.2药物和试剂DZ、格列苯脲购自Sigma公司;ICAM-1免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司;放免试剂盒购于解放军总医院放免研究所。1.3合理输注离体灌注模型A组:10只动物,取正常心肌;B组:10只动物,取心脏,建立离体灌注模型,Krebs-Henseleit缓冲液预灌注15min,待心脏稳定搏动后,32℃停灌30min,复灌30min;C组:10只动物,取心脏,建立离体灌注模型,Krebs-Henseleit缓冲液预灌注15min,待心脏稳定搏动后,给予常规含钾停搏液灌注,32℃停灌30min,复灌30min;D组:10只动物,取心脏,建立离体灌注模型,待心脏稳定搏动后,给予常规含钾停搏液+DZ(20mg/kg)灌注,33℃停灌30min,复灌30min;E组:10只动物,取心脏,建立离体灌注模型,待心脏稳定搏动后,给予格列苯脲(3mg/kg),10min后给予停搏液+DZ灌注,33℃停灌30min,复灌30min。1.4血清血管内皮功能动物麻醉后迅速切开胸腔,游离心底部,在保留适当主动脉长度下切除心脏,置于4℃Krebs-Henseleit缓冲液中保存并挤出心脏中的血液,迅速插管并固定。用Krebs-Henseleit缓冲液行Langendorff逆行冠状动脉灌注,恢复心脏搏动。整个灌注系统保持37℃。1.5免疫组化检测实验终了取冠状动脉流出液4ml,放免法测定NO、ET含量;取心肌,制备冷冻切片,免疫组化检测ICAM-1表达,并在放大400倍荧光显微镜下摄取图像,用多媒体彩色图文分析系统,测定平均灰度表示细胞化学反应强度量的变化;制备心肌组织匀浆液,放免法测定TNF-α、MPO含量,电镜观察内皮细胞与心肌细胞损伤。1.6统计学处理所有数据均采用均数±标准差(x¯±(x¯±s)表示。并经国际通用统计分析系统SPSS11.0统计软件处理。取α=0.05作为差异显著性的检验标准。2结果2.1c组不同给于常规停采血液保护后tnf-含量TNF-α含量变化A组心肌TNF-α含量较低,B组则明显增高,与A组比较有显著性差异(P<0.01),而C组给于常规停搏液保护后TNF-α含量显著降低(P<0.01)。D组心肌TNF-α含量虽然仍明显高于正常,但较C组也有明显降低(P<0.05),相反E组TNF-α含量与C组无显著差异,明显高于D组(P<0.05)。具体见表1。2.2mpo表达情况MPO含量变化各组MPO表达变化趋势与TNF-α基本一致。A组心肌组织MPO的表达均较微弱;而B组可见到MPO表达较A组显著增高(P<0.01),C组MPO表达与B组相比有明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。D组心肌MPO含量较C组也有明显降低(P<0.01),但仍明显高于正常,相反E组MPO含量与C组无显著差异,明显高于D组(P<0.01)。具体见表1。2.3组小鼠icam-1表达情况ICAM-1表达的变化A组心肌组织ICAM-1的表达均较微弱;而B组可见到ICAM-1表达较A组显著增高(P<0.01),C组ICAM-1表达与B组相比有明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。D组心肌ICAM-1含量较C组也有明显降低(P<0.05),但仍明显高于正常,E组ICAM-1含量明显高于D组(P<0.05),但仍低于C组(P<0.05)。具体见表1。2.4no表达与心肌no含量NO表达的变化A组心肌组织NO的表达均较微弱;而B组可见到NO表达较A组显著降低(P<0.01),C组NO表达与B组相比有明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。D组心肌NO含量较C组也有明显升高(P<0.01),与正常组已无显著性差异,E组NO含量明显低于D组(P<0.05),与C组比较差异无显著性。具体见表1。2.5组et表达情况对比ET表达的变化A组心肌组织ET的表达均较微弱;而B组可见到ET表达较A组显著增高(P<0.01),C组ET表达与B组相比有明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。D组心肌ET含量较C组也有明显降低(P<0.01),但仍明显高于正常,E组ET含量明显高于D组(P<0.01),与C组无显著性差异。具体见表1。2.6c组心肌结构正常,少数炎性细胞浸渍B组心肌可见炎性细胞浸润,并出现心肌间质水肿和灶性心肌坏死;C组心肌结构也基本正常,可见少数炎性细胞浸润;而D组心肌结构基本正常,可见散在炎性细胞浸润,无明显间质水肿和心肌坏死。见图1,2,3。3开放连续给药方案促进心肌保护作用血管内皮细胞结构和功能的严重损伤是构成缺血再灌注损伤病理生理过程的基础之一。心脏直视手术中心肌缺血及再灌注过程中可能通过以下途径参与心肌损伤:①再灌注时释放TNF-α等细胞因子、ICAM-1等粘附分子,可导致白细胞激活和粘附,并向心肌组织内浸润,导致心肌损伤;②内皮细胞功能失调,分泌内皮源性舒张因子,即NO减少,血管对NO反应下降,血管收缩,参与无复流现象的发生;③表达ET和血小板活化因子等缩血管物质,不仅引起强烈的血管收缩,加重微血管和心肌细胞的损伤,而且还促进内皮细胞表达粘附分子,加强内皮细胞与中性粒细胞的粘附以及粒细胞的浸润。国外研究发现,给予MitoKATP通道开放剂二氮嗪可减轻心肌缺血再灌注损伤,但对其机制尚不清楚。Klaver等发现,利多卡因和异氟醚可减轻细胞因子所导致的内皮细胞和血管平滑肌细胞损伤,而格列本脲能阻断这种保护作用,说明其保护作用可能是通过线粒体K+通道开放剂实现的。而国内王翠梅等却认为线粒体K+通道不参与异丙酚预处理的心肌保护作用,这说明线粒体K+通道开放是否能通过对内皮系统的保护起到心肌保护作用仍有争议。本实验通过制备Langendorff灌注模型,观察缺血再灌注心肌血管内皮细胞改变以及二氮嗪对其保护作用。本实验中观察到,缺血再灌注心肌血管内皮细胞结构损伤,TNF-α、ICAM-1等炎症介质表达明显增高,NO、ET等血管活性物质表达发生明显改变;同时,心肌细胞明显损伤。给予常规停搏液可使血管内皮细胞损伤减轻、炎症介质释放降低,相应的心肌损伤减轻,而给予DZ后这种保护作用得到了明显的加强,但预先给予MitoKATP通道阻断剂格列本脲后DZ则不能发挥这种保护作用。这充分说明,开放MitoKATP通道可通过对心肌血管内皮细