氟苯尼考对杂色鲍幼鲍感染脓疱病的治疗效果

氟苯尼考对杂色鲍幼鲍感染脓疱病的治疗效果

不同颜色的鲍是中国台湾、福建、广东、海南等南方沿海地区的重要经济贝类。然而，近年来，随着养殖规模的不断扩大，细菌引起的疾病变得越来越猖獗。在粤东沿海杂色鲍养殖区,在高温季节稚鲍(壳长0.3~0.5cm)常在从取食硅藻的附着基脱落死亡,或对幼苗(1.5~3.0cm)进行转池、运输、进笼等操作后几天内出现部分死亡,死亡率约20%~40%,相当比例濒死幼苗腹足出现1~3个直径2~4mm不等的微隆起脓疱,脓疱破裂流出白色脓汁后显现深1~3mm左右的小洞,鲍附着力下降,不能翻身,失去活力而死亡,症状与报道的我国北方皱纹盘鲍脓疱病相似,但与杂色鲍溃疡症有所不同。病原菌初步鉴定为Myroidesodoratus(Flavobacteriumodortum),编号NPB-03,由本实验室分离保存。氟苯尼考(florfenicol)为我国二类新兽药,具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广泛和副作用低等特点,作者曾尝试用于防治鲍“掉板症”,获得一定效果。本实验以不同浓度的氟苯尼考药浴处理人工感染致病的幼鲍脓疱病,探讨该药的治疗效果,以便指导实际生产中的病害防治。1材料和方法1.1健康苗的选择(1)杂色鲍苗由深圳市南澳海珍品养殖有限公司惠赠,体长(2.44±0.37)cm,体重(1.21±0.47)g,室内暂养2d后,选择健康苗供用。(2)氟苯尼考为横店集团得邦药业(兽药)有限公司公司生产,批号19010901,标示纯度>98%,用少量助溶剂配制母液,4℃储存备用。(3)保存于-20℃的NPB-03菌株于2216E斜面27℃下活化培养24h后,无菌生理盐水洗脱。(4)试验用清洁海水经氯制剂消毒后除残氯,水温25.5~26.5℃,pH7.9~8.2,海水比重1.022。1.2感染试验1.2.1洗澡以800mL清洁海水稀释菌液成终浓度约106cell·mL-1,浸浴健康无伤鲍苗14粒,24h后移至烧杯中清洁海水饲养。1.2.2氟苯尼考的感染用无菌解剖刀片沿鲍苗(90粒)腹足中间部位纵向划长3mm、深2mm左右的创伤,75粒浸泡于106cell·mL-1浓度菌液中24h后分5组移至1L烧杯中处理,A、B、C、D组分别为1、3、6和10μg·mL-1终浓度的氟苯尼考药液浸浴;Ck-E为创伤无药物处理的感染对照组;Ck-F为创伤无药物无感染处理的对照组。1.2.3两组菌液外溢试验鲍苗腹足用75%酒精消毒后,50μL微量进样器于中间部位45度角刺入3~4mm深,注射10μL浓度约108cell·mL-1生理盐水菌液后露空放置5min,以菌液无外溢为合格,药物处理和组别同创伤试验,同时设仅注射生理盐水对照组Ck-G和注射菌液但无药物处理的对照组Ck-H。1.3正常患者,无反应设无任何处理的对照组Ck。每天仔细观测鲍临床症状,以附着力强且能自行翻身,而腹足无脓疱的判定为正常,以出现脓疱症状,或附着力和活力差,但触角和腹足对外界刺激仍有收缩反应的判定为发病,以掉入烧杯底触角和腹足对外界刺激无任何反应的判定为死亡。所有试验于1L烧杯中800mL药液(或清洁海水)中进行,停饵、微量充气,每24h更换新鲜药液(或清洁海水)。2结果2.1创伤和局部感染浸浴感染24h期间及其后的96h内没有出现任何发病和死亡症状,显示M.odoratusNPB-03菌株不能通过体表或鳃侵染鲍苗,推测可能也不会通过肠道感染。创伤感染24h内即出现病症,随后24h出现死亡,沿创伤部位出现1~3个直径2~3mm脓疱,个别鲍苗出现直径4mm左右的单个脓疱,脓疱周围上皮色素脱落,鲍苗的附着力和活力下降而逐渐死亡,临床症状与养殖场池中的脓疱病相似。但注射感染组脓疱症状不明显,注射点部位仅有小面积液化,腹足松弛无力,出现发病症状至死亡过程明显较创伤感染短。在2216E培养基上从濒死鲍淋巴液、消化腺或脓疱中都重新分离到NPB-03菌株。2.2疗效显著对创伤感染和注射感染诱导发病的治疗效果见表1。结果显示96h累积发病率和死亡率与药物处理浓度呈负相关性,药物在各浓度下对创伤感染的疗效明显优于注射组。1和3μg·mL-1浓度氟苯尼考药浴对注射感染没有显示任何治疗效果,48h死亡率接近100%,10μg·mL-1氟苯尼考浓度药浴才呈现明显效果与我们对该药在杂色鲍体内吸收和消除代谢研究相符,如10μg·mL-1浓度药浴下,1h后鲍淋巴液中氟苯尼考浓度才可稳定的维持在0.6~0.8μg·mL-1间(另文发表),该浓度大致为氟苯尼考对一般水产病原菌的MIC值。3发酵筛选中细菌的感染Myroidesodoratus为1996年从原气味黄杆菌F.odoratum重新分类的新属新种(另一种为M.odoratimimus),如NPB-03菌株被本实验室Biolog细菌鉴定系统鉴定为M.odoratus。F.odortum是人类临床上较常见的条件致病菌,可引起人类外科手术、尿道、菌血症、肺炎等感染,广泛分布于土壤和水中,目前还未见引起水生动物感染的报道,国内曾作为水产病原弧菌的拮抗菌被研究过。鲍鱼为开放式循环、无特异性免疫的无脊椎动物,对外来异物的清除主要通过淋巴液中血细胞的吞噬作用,本试验中鲍腹足创伤后立即可见在伤口处分泌大量混合有血淋巴的粘液,在106cell·mL-1浓度菌液中浸浴可部分阻止、延缓或消除细菌的入侵,脓疱的形成可能也是一种应激条件下的保护反应。而腹足肌肉深层注射106cell量的细菌,在短时间内可能超过淋巴血细胞对其的清除能力,细菌随淋巴液的流动很快侵染各脏器引起菌血症而死亡。高浓度菌液浸浴不能形成感染,显示M.odoratus对鲍是一种条件致病菌,这与刘金屏等报道的皱纹盘鲍H.discus脓疱症病原V.fluvialis-Ⅱ相似,其注射感染死亡率也高于创伤感染。国内鲍报道的其他病原菌还有溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、亮弧菌-Ⅱ(V.splendids-Ⅱ)、创伤弧菌(V.vulnificus)、坎氏弧菌(V.campbellii)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)等,但这些报道中依据药敏实验推荐的抗菌药物氯霉素、呋喃唑酮、环丙沙星、氟哌酸、复方新诺明等现已大多被列为违禁品。有报道应用土霉素注射或口服治疗立克次氏体引起的黑鲍H.cracherodii和红鲍H.rufescens萎缩症,但在我国鲍工厂化养殖条件下口服用药方式仍较为困难。氟苯尼考口服在一些水产动物上已显示优良治疗效果和安全性,鉴于目前我国鲍在贝类养殖中的重要经济地位,在苗种培育阶段及亲鲍病害防治中可以探讨应用氟苯尼考药浴,虽有皱纹盘鲍对氯霉素的吸收和扩散研究报道,但药浴条件下鲍对氟苯尼考的吸收、分布、代谢和消除等还需作进一步的研究。本试验中对已被病原菌感染的鲍需6~10μg·mL-1高的浓度氟苯尼考才可有效控制病程发展,显示无体内药效学研究背景下,我国以往