11种植物提取物对4种病原细菌的抑菌活性筛选

\o"11种植物提取物对4种病原细菌的抑菌活性筛选"11种植物提取物对4种病原细菌的抑菌活性筛选植物源杀菌剂含有选择性高、环境和谐、对非靶标生物安全、低毒、低残留等优点，从植物中寻找抑菌活性物质，是研发新型杀菌剂的热点之一。现在，中国开发与应用的植物源杀菌剂重要有苦参碱、黄岑苷、小檗碱、丁子香酚、香芹酚、儿茶素、大蒜素、乙蒜素、大黄素甲醚等。但前述产品多集中于对植物真菌病害的防治，对植物源杀细菌剂的研究大多侧重于食品污染菌的控制，且大多数还处在室内筛选阶段。魏希颖等研究发现泡桐花提取液对金黄色葡萄球菌有很强的克制作用。叶舟测定了木麻黄（CasuarinaequisetifoliaForst）小枝提取液的抑菌活性，发现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌体现出较强的克制活性。崔彦等的研究证明五倍子、丁香、地榆对黄瓜细菌角斑病菌体现出明显的克制作用，其中五倍子提取物的活體防效可达60%，含有一定的开发潜力。李玉玲发现竹焦油对甘蓝黑腐病菌、番茄细菌性斑点病菌、茄青枯病菌等多个供试细菌都有不同程度的克制活性。为了获得对植物细菌病害有广泛抑菌谱的植物源物质，本研究选用已报道过的含有广泛抑菌活性的11种植物提取物，对魔芋软腐病菌、猕猴桃溃疡病菌、核桃黑斑病菌、白菜软腐病菌4种常见的病原细菌进行室内抑菌活性筛选，旨在为新型植物源杀细菌剂的开发研究提供线索。1材料与办法

1.1材料

1.1.1供试菌种魔芋软腐病菌（Erwiniacarotovorapv.carotovora）、猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonassyringaepv.actinidiae）、白菜软腐病菌（Erwiniacarotorora）均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供；核桃细菌性黑斑病菌（Xanthomonascampestrispv.juglandis）由西北农林科技大学林学院提供。

1.1.2供试植物源物质及试剂大黄提取物（其中大黄素含量为0.30%）、博落回提取物（其中血根碱含量为0.57%）、狼毒提取物（其中狼毒素含量为1.90%）、皂荚提取物（其中皂荚素含量为6.90%）、苦参提取物（其中苦参碱含量为2.15%）均由山西德威生化有限公司提供。90%的小檗碱、蛇床提取物（其中蛇床子素的含量为10%）、藜芦生物碱（其中藜芦胺含量为2.30%）、98%的肉桂酸、98%的丁香酚、98%的柠檬酸铜均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。72%的农用链霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。丙酮、葡萄糖、琼脂粉、氯化纳、胰蛋白胨、酒精、牛肉膏、酵母粉均购于陕西天成化玻有限公司。

1.2办法

1.2.1培养基配制办法室内生测用于细菌性病原菌的培养与保存的固体培养基（NA）：称取琼脂粉15g、

蛋白胨5g、牛肉膏3g，加水至1L，灭菌锅灭菌待用；用于活化细菌性病原菌菌株的液体培养液（LB）：称取胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠3g，加水至1L，灭菌锅灭菌待用。

1.2.2药剂配制采用对供试病菌没有抑菌作用的丙酮作为溶剂，将供试植物源物质溶解。用20%丙酮-水溶液将各植物源提取物或化合物按其有效成分含量溶解稀释成2000μg/mL药液（作为母液备用）。用无菌水将各母液分别依次2倍稀释最后拟定为1000、500、250、125、62.5μg/mL5个浓度梯度解决，均以浓度为200μg/mL的72%农用链霉素作药剂对照，采用对供试细菌没有抑菌作用的20%丙酮-水溶液作为空白对照，每个解决重复3次，以减少误差。

1.2.3供试菌种的准备将供试菌种在实验前1d转接到LB培养液中，置于28℃恒温摇床箱中活化12h。用无菌水调配成菌液浓度为1×106CFU/mL，以供室内抑菌活性筛选使用。

1.2.4琼脂扩散法室内抑菌活性筛选办法采用琼脂扩散法进行室内抑菌活性筛选，将溶化的营养琼脂培养基冷却至45～50℃，加入活化好的细菌数量不不大于106CFU/mL的供试菌悬液摇匀（成带菌培养基）。每次取15mL的带菌培养基，分别倒入直径为9cm的玻璃培养皿中，制成带菌平板。待冷却后用直径为9mm的打孔器在平板上均匀打3个孔，并用接种针挑出孔中培养基，在每孔内加入75μL配好的供试植物源物质，以200μg/mL的农用链霉素作为药剂对照，并以丙酮作为溶剂对照，每组解决重复3次。置于28℃恒温培养箱中培养24h后观察成果，用直尺按十字交叉法测量抑菌圈直径（减去孔径9mm）求取平均值，进行比较。

1.2.5最低有效克制浓度（MIC）的测定办法采用二倍稀释法测定待测植物源物质的MIC值，取编号为1～11的试管以及适量的蒸馏水，放入灭菌锅里灭菌待用。灭菌完毕后，取无菌试管，分别往试管内加入2mL无菌水。将2mL浓度为2000μg/mL待测药液加入1号试管中，摇匀后，将混合后的药液2mL加入2号试管中，依次操作到10號管为止，弃掉10号管中的2mL药液，使各个试管中的药液体积同样，将11号管设为空白对照，加入同等含量丙酮的水溶液。每种病菌设3组重复解决。最后将稀释好的细菌数量达104CFU/mL的病原菌菌悬液2mL分别加入1～11号试管中，置于适宜的温度培养箱中培养，待空白对照试管菌液出现浑浊，观察成果，进行比较。成果判断：由于菌液与药液等量混合，相称于将药液二倍稀释，最后待测药液为10个浓度梯度，分别为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、1.8、0.9μg/mL。

成果观察：通过肉眼比对发现试管内液体澄清透明经震荡后仍无沉淀产生，则此试管对应的药液浓度即为此药剂看待测病菌的MIC值。

1.3数据分析

运用SPSS20.0软件对数据进行统计分析。

2成果与分析

2.111种植物提取物对4种病原细菌的室内抑菌活性筛选

2.1.1魔芋软腐病菌的室内抑菌活性筛选采用琼脂扩散法测定了11种植物提取物对魔芋软腐病菌的克制活性，成果表明，供试11种植物提取物对魔芋软腐病菌的克制效果有明显的差别。大黄、狼毒、博落回提取物、小檗碱、肉桂酸和藜芦生物碱6种植物提取物对魔芋软腐病菌都有不同程度的克制作用（表1），皂荚、苦参、蛇床提取物及丁香酚、柠檬酸铜对魔芋软腐病菌则无明显克制效果。由表1可看出，博落回提取物对魔芋软腐病菌的克制作用最强，浓度在1000μg/mL时，抑菌圈直径最高达（19.3±0.30）mm；另首先是大黄、狼毒提取物，抑菌圈直径分别为（17.3±0.48）、（11.9±0.26）mm，均高于或相称于对照药剂农用链霉素200μg/mL的抑菌圈直径（12.6±0.26）mm；同时，小檗碱、藜芦生物碱的抑菌圈直径也达成了（10.0±0.26）、（10.1±0.34）mm，对魔芋软腐病克制作用较好；肉桂酸仅有微弱抑菌活性，其1000?g/mL解决抑菌直径仅（0.3±0.10）mm。

2.1.2猕猴桃溃疡病菌的室内抑菌活性筛选通过对猕猴桃溃疡病菌的室内活性筛选成果表明（表2），在浓度为1000μg/mL时，大黄和狼毒提取物抑菌圈直径分别为（13.3±0.47）、（12.2±0.32）mm，均不不大于对照药剂农用链霉素浓度在200μg/mL时的抑菌圈直径（12.0±0.18）mm；博落回、皂荚、苦参、蛇床提取物对病原菌克制作用次之，最大抑菌圈直径在6.7～9.8mm之间；柠檬酸铜的最大抑菌圈直径为（0.2±0.00）mm，抑菌作用较弱；小檗碱、丁香酚、肉桂酸以及藜芦生物碱则无明显克制效果，故在表2中未列出。2.1.3核桃黑斑病菌的室内抑菌活性筛选从表3成果可看出，蛇床子提取物对核桃黑斑病菌的抑菌作用最佳，在浓度为1000g/mL时，抑菌直径达成（12.7±0.13）mm，另首先是苦参提取物，抑菌圈直径为（10.0±0.23）mm。皂荚提取物、丁香酚、肉桂酸对核桃黑斑病菌也有一定的克制作用。大黄、博落回、狼毒提取物、小檗碱、柠檬酸铜以及藜芦生物碱对核桃黑斑病菌无克制作用，在表3中未列出。而药剂对照链霉素在200?g/mL时抑菌圈直径达（17.0±0.58）mm。由此表明，这11种植物提取物对核桃黑斑病菌克制作用不明显。

2.1.4白菜软腐病菌的室内抑菌活性筛选实验成果（表4）表明，在11种供试植物提取物中，仅苦参提取物、丁香酚和肉桂酸对白菜软腐病菌有抑菌作用，而大黄、博落回、狼毒、蛇床子提取物、小檗碱、柠檬酸铜、藜芦生物碱及皂荚提取物对白菜软腐病菌无明显克制作用，在表4的抑菌活性筛选的成果中未列出；苦参提取物、丁香酚和肉桂酸对白菜软腐菌都有一定的克制作用但不明显，其最大的抑菌圈直径均比对照药剂农用链霉素在200?g/mL时的抑菌圈直径小。

2.2抑菌活性较好的植物源物质的MIC测定成果

2.2.15种植物提取物对魔芋软腐病菌的MIC测定成果由表5可知，大黄和博落回提取物对魔芋软腐病菌的MIC值分别为7.8、15.6?g/mL，均明显低于对照农用链霉素的MIC值31.3?g/mL。狼毒提取物、小檗碱和藜芦生物碱的MIC值分别为125、62.5、250?g/mL，体现出一定的抑菌活性，与表1的抑菌圈实验成果基本一致。综合表1和表5可知，大黄和博落回提取物对魔芋软腐病菌的抑菌作用最为明显，有进一步研究的潜力。同等含量丙酮的水溶液对魔芋软腐病菌的MIC值无影响。

2.2.26种植物提取物对猕猴桃溃疡病菌的MIC测定成果从表6可知，大黄提取物对猕猴桃溃疡病菌的MIC值与对照农用链霉素均为3.9?g/mL，表明猕猴桃溃疡病菌对大黄提取物比较敏感。另首先苦参和狼毒提取物的MIC值均达成15.6?g/mL，皂荚和博落回提取物分别为31.3、250?g/mL，与表3的抑菌活性筛选成果基本相似。结合表5～6可看出，大黄、博落回和狼毒提取物对魔芋软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌都有明显的克制作用，体现出广谱的抑菌活性。同等含量丙酮的水溶液对猕猴桃溃疡病菌的MIC值无影响。

2.2.33种植物提取物对核桃黑斑病菌的MIC测定成果由表7可见，核桃黑斑病菌对农用链霉素最敏感，其MIC值为7.8?g/mL。皂荚、苦参和蛇床子、提取物的MIC值分别为15.6、31.3、15.6?g/mL，也体现出较好的抑菌活性。同等含量丙酮的水溶液对核桃黑斑病菌的MIC值无影响。

3讨论

本研究采用琼脂扩散法、二倍稀释法对11种植物提取物对魔芋软腐病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃细菌性黑斑病菌4种病原细菌的抑菌活性进行了研究。成果表明大黄、博落回和狼毒提取物均含有明显克制植物病原细菌的活性，有开发为新型植物源杀细菌剂的潜力。其中，大黄提取物对魔芋软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌的克制效果最为突出；博落回提取物对魔芋软腐病菌、狼毒提取物对猕猴桃溃疡病菌、蛇床提取物对核桃黑斑病菌的MIC均在20?g/mL下列，与对应的对照药剂农用链霉素的MIC值相称，有明显的抑菌活性。苦参、蛇床子和皂荚提取物對特定病菌有良好的克制活性，在杀细菌应用上有研究的价值。

狼毒、大黄和博落回提取物在抗细菌作用方面的研究甚少，且多集中于医药、食品研究。前人的=研究表明，狼毒石油醚提取物的杀烟蚜活性最佳；瑞香狼毒提取物对小菜蛾、枸杞蚜虫有十分明显的毒杀活性。南苹瑶等发现大黄乙醇提取物对大肠埃希菌ATCC25922的体外抑菌作用明显。Hazni等研究成果显示，大黄素对金黄色葡萄球菌、溶血溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等都有较强的克制作用；李文娟研究证明瑞香狼毒（StellerachamaejasmeL.）乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最明显，其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度为0.63mg/mL；郁建平研究发现盐酸血根碱含有很强的广谱抑菌作用，对木霉、根霉、黄曲霉、黑曲霉、米曲霉、毛霉、酵母的最低抑菌浓度均低于40?g/mL。杨军辉等发现牛角瓜根的石油醚粗提物对枯