rp-hplc法同时测定栀子中3种成分的含量

rp-hplc法同时测定栀子中3种成分的含量

栀子是蔷薇科植物的干燥成熟果实。这是一种常见的药物品种之一，具有清火除苦、清热利尿、凉血解毒的功效。黄酮、环烯醚萜苷和水溶性色素类是其主要有效部位。栀子苷等黄酮苷类具有抗炎、解热、利胆和轻泻作用,西红花苷等水溶性色素类成分具有抗动脉粥样硬化及降血脂作用。栀子多用栀子苷为定量控制指标,进行质量控制[1、5]。栀子生长地区非常广泛,农家种植品种较多,不同地区种植的栀子差异很大。笔者收集了河南、广西、江西、贵州等栀子主产区的不同产地的14批样品,采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法对样品中栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的含量进行测定,以期为栀子的质量评价提供科学依据。1药品、试剂与标准品HPLC仪,包括2695溶剂管理系统、2996二极管阵列检测器、柱温箱、Empower2工作站(美国Waters公司);ASS150超声波提取器(济宁科特超声电子有限责任公司);LIBROR-160DPT万分之一分析天平(日本岛津公司);AE240十万分之一分析天平(瑞士MettlerToledo公司)。甲醇为色谱纯(德国Merck公司),水为超纯水,其余试剂均为分析纯;栀子苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110749-200612,供含量测定用);西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ标准品(金测分析技术(天津)有限公司,供含量测定用,纯度均>98%);供试药材来源见表1,经河南省中医药研究院都恒青研究员鉴定均为茜草科植物栀子G.jasminoidesEllis的成熟果实,凭证标本存放于河南省中医药研究院中药室。2方法和结果2.1标准曲线及线性结果色谱柱:ThermoODSC18(250mm×4.6mm,5µm);流动相:甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0→10min,A为10%→20%;10→25min,A为20%;25→32min,A为20%→52%;32→40min,A为52%;40→42min,A为52%→75%;42→50min,A为75%;50→51min,A为75%→10%);流速:1.0mL·min-1;柱温:40℃;检测波长:238nm(栀子苷)、440nm(西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ);进样量:10µL。按上述色谱条件,分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10µL,注入液相色谱仪。结果表明,栀子苷、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的色谱峰分离良好。色谱见图1。2.2溶液的制备2.2.1%分类测定栀子苷的表达精密称取栀子苷对照品与西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ标准品,加甲醇制成每1mL分别含栀子苷224μg、西红花苷-Ⅰ71.0μg、西红花苷-Ⅱ13.0μg的混合溶液,即得。2.2.2超声处理法精密称取栀子细粉0.2g,置具塞三角瓶中,精密加入甲醇25mL,称定重量,超声处理30min,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足失重,摇匀,过滤,续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过,即得。2.3线性范围与检出限精密吸取混合对照品溶液2、5、10、15、20、25μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ色谱峰峰面积积分值,并以峰面积积分值(Y)为纵坐标,进样量(X)为横坐标,进行线性回归,得3种成分的回归方程、相关系数与线性范围,见表2。2.4栀子苷的测定取河南唐河同一批次的供试品溶液,按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24h注入液相色谱仪,进样10μL。结果,栀子苷的平均峰面积为5747259,RSD=0.49%(n=7);西红花苷-Ⅰ的平均峰面积为4087163,RSD=0.76%(n=7);西红花苷-Ⅱ的平均峰面积为16199,RSD=0.92%(n=7),表明供试品溶液在24h内稳定性较好。2.5色谱条件分析精密吸取同一供试品溶液10μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件进行分析,连续重复进样6次。结果,栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的RSD分别为1.32%、1.52%、1.50%(n=6),表明本方法精密度较好。2.6不同水红树莓苷、西红豆苷含量的测定取同一批栀子药材,照“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,按上述拟定的含量测定方法操作。结果,栀子苷的平均含量为45.66mg·g-1,RSD=1.61%(n=6);西红花苷-Ⅰ的平均含量为7.792mg·g-1,RSD=1.68%(n=6);西红花苷-Ⅱ的平均含量为1.684mg·g-1,RSD=1.23%(n=6),表明本方法重复性较好。2.7供试品溶液制备取已知含量(栀子苷:46.71mg·g-1,西红花苷-Ⅰ:7.20mg·g-1,西红花苷-Ⅱ:1.80mg·g-1)的样品共6份,精密称取0.1g,置具塞三角瓶中,分别精密加入栀子苷、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ混合对照品甲醇溶液(栀子苷、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ浓度分别为0.1912mg·mL-1、26.78μg·mL-1、6.82μg·mL-1)25mL,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。吸取加样供试品溶液10μL注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的含量,计算加样回收率,结果见表3。2.8样品含量的测量精密称取样品适量,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,对不同产地14批栀子药材进行测定,每批平行测定3次,结果见表4。3不同产地栀子苷与西红树莓类成分的检测比较在供试品溶液制备过程中,分别考察了回流、冷浸、超声等多种提取方法。结果表明,超声30min即可提取完全,且操作简便、快捷,供试品溶液中杂质成分含量较低,不干扰待测成分的检验。试验中还对溶媒种类、溶媒用量、超声时间等因素进行了考察,最后确定供试品溶液的制备方法为栀子药材细粉加25mL甲醇超声提取30min。栀子中栀子苷与西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ极性差异大,为使栀子苷等黄酮苷类成分和西红花苷类色素类成分的色谱峰具有较好的分离度,笔者在试验中反复调节流动相梯度,根据预试验结果确定了梯度洗脱程序。在试验中,分别对栀子苷色谱峰与西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ色谱峰进行吸收光谱扫描,结果发现栀子苷峰在238nm波长处有最大吸收,西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ色谱峰在440nm波长处有最大吸收,与2005年版《中国药典》(一部)中栀子苷与西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的测定波长一致。因此,选择0~30min、238nm,30~50min、440nm分别作为栀子苷与西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的检测波长。采用WatersEmpowerⅡ色谱工作站的定时波长功能,选取32min为检测波长转换点,使检测波长由238nm变为440nm,在同一色谱条件下同时检测栀子中的栀子苷和西红花苷类成分。此法不仅可以用于DAD检测器,也可用于普通的多波长紫外检测器,具有普遍适用性,方便、快速。本试验结果表明,14个不同产地的栀子药材样品中栀子苷的含量均符合2005年版《中国药典》不得低于1.8%的有关规定。不同产地栀子中的栀子苷与西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的含量差异显著。栀子苷与西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的含量无明显相关性,而西红花苷-Ⅰ与西红花苷-Ⅱ的含量呈正相关。西红花苷-Ⅰ和西红