浊点萃取-高效液相色谱法测定牛奶中三聚氰胺

浊点萃取-高效液相色谱法测定牛奶中三聚氰胺

云萃取是一种新型的液相萃取技术。根据表面活性剂束溶液的溶解度特性和云沉淀现象，通过改变温度和湿度等操作条件，导致相分离，并将亲水材料与亲水性材料分离。该方法不仅避免了大量挥发性有机溶剂的使用,并且表面活性剂用量小,体系组成简单,条件温和,易于操作,具有经济、安全、高效、简便等优点。该技术已广泛应用于金属离子、蛋白质的分离、天然药物活性成分的提取及土壤和水中农药残留的分析。三聚氰胺简称三胺,又称蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物。三聚氰胺的检测方法主要有:苦味酸法、升华法、电位滴定法、重量法,以及酶联免疫(ELISA)试剂盒法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、毛细管电泳以及近红外检测法等。本文选用非离子表面活性剂(TritonX-100)为破乳试剂,非离子表面活性剂(PEG600)为萃取剂,对牛奶中三聚氰胺的浊点萃取行为进行研究,为建立三聚氰胺快速检测技术提供有效手段。1实验部分1.1hh-s16s俄Waters单泵液相色谱仪:515泵,紫外可见检测器,HederaODS-2-C18色谱柱(250mm×4.6mm);离心机(6000r/min);HH-S26S数显恒温水浴锅。三聚氰胺(纯度不小于98.5%,成都市科龙化工试剂厂),配成100mg/L的储备液;PEG600配成300g/L的水溶液,TritonX-100配成200g/L的水溶液;Na2SO4、Na2CO3、柠檬酸均为分析纯;乙腈和庚烷磺酸钠均为色谱纯;离子对试剂缓冲溶液(取2.10g柠檬酸、2.02g庚烷磺酸钠配制,定容至1L,pH3.0);三氯乙酸(分析纯,南京化学试剂厂)。1.2实验方法1.2.1u3000酸、碱分别加热在刻度试管中加入5g(精确至0.01g)牛奶,再分别加入TritonX-100和CCl3COOH,使其终质量浓度均为20g/L,混匀,在100℃水浴中加热10min,然后以6000r/min离心10min。移出上清液并用蒸馏水洗涤,合并清液,用蒸馏水定容至10mL。取样液5.0mL,分别加入PEG600、Na2SO4和Na2CO3,使其终质量浓度分别为130、260、5g/L,70℃水浴中平衡30min,使其分层,移走水相。1.2.2流动相密度的影响采用C18反相色谱柱,以离子对试剂缓冲液和乙腈为流动相(体积比为9∶1),以0.8mL/min的流速,定量进20μL的胶束样(0.25μm微孔纤维膜过滤),在240nm波长下进行分析。2结果与讨论2.1破乳剂条件优化2.1.1氯乙酸质量浓度对破乳效果的影响分别使用盐酸、磷酸、三氯乙酸、醋酸对牛奶进行破乳,实验发现,三氯乙酸的破乳速度最快。考察了不同质量浓度(5~60g/L)的三氯乙酸对破乳的影响。实验表明,三氯乙酸的质量浓度大于20g/L时,破乳速度以及破乳程度均比较理想,实验选用20g/L三氯乙酸。三氯乙酸破乳的同时,能够给三聚氰胺提供酸性环境,使其很好地溶解在清液中,减少因破乳而引起的目标检测物的损失。2.1.2tri能力的影响加入酸的同时加入无机盐,可以加快牛奶的破乳速度并提高破乳的程度,但会使牛奶中的乳脂颗粒絮凝于清液上部,给清液的完全取出带来困难,而采用TritonX-100代替无机盐时,乳脂颗粒的絮凝速度快于未加TritonX-100或加盐时的速度,且离心后乳脂颗粒沉积于清液底部,分离效果较为明显。考察了TritonX-100的浓度对破乳的影响,实验表明,TritonX-100的质量浓度低于20g/L时,仍有部分乳脂颗粒絮凝于清液上部,质量浓度大于20g/L时,絮凝物完全沉积于清液底部,但随着TritonX-100浓度的增大,牛奶样品的处理液有一定的粘度,且使样液带有一定的泡沫,给样品的分离带来困难。综上,选取TritonX-100的浓度为20g/L。2.1.3in破乳热反应时间对破乳效果的影响考察了加热温度(50~100℃)、加热时间(5~20min)对破乳效果的影响。实验发现,加热温度高于80℃时即可破乳,加热温度越高,破乳速度越快,破乳效果越理想,实验选用100℃水浴。100℃水浴加热10min,即达到完全破乳。2.2优化废点提取条件2.2.1胶束相及质量浓度考察了表面活性剂Tween-20、Tween-60、PEG600、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000对回收率的影响(见图1)。实验结果表明,Tween-20、Tween-60、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000的胶束相均过于粘稠,不能直接进样,且回收率均低于60%。只有PEG600既能够实现相的分离,又能获得最大回收率,且由于其粘度很低,便于进行液相色谱分析,因此选用PEG600。对PEG600的质量浓度(50~160g/L)进行考察,发现其质量浓度达到130g/L时,回收率最大,随后再增加PEG600质量浓度对回收率的影响不大。因此选择PEG600的质量浓度为130g/L。2.2.2so4和na2co3盐能够加快相分离。考察了Na2SO4和Na2CO3两种盐对浊点萃取的影响,结果表明,单独加入Na2CO3时,随着Na2CO3的用量增大,目标检测物回收率虽有增加,但共萃物亦增多,且有一杂质峰与目标峰难分离,而用Na2SO4代替Na2CO3时,能够克服上述缺点。而加入Na2SO4的同时加入少量Na2CO3,可使萃取过程在弱碱性环境下进行,回收率大于单独使用Na2SO4时的回收率。同时考察了不同质量浓度的Na2SO4(100~280g/L)和Na2CO3(0~10g/L)对回收率的影响,实验表明,随着Na2SO4用量的增大,回收率亦增大,当Na2SO4的质量浓度达到260g/L时,回收率最大,再增大Na2SO4的用量对回收率的影响不大;随着Na2CO3用量的增大,回收率亦增大,但当Na2CO3的质量浓度大于5g/L时,共萃物增多,且出现了与目标峰难分离的杂质峰。实验中所用的Na2SO4和Na2CO3的质量浓度分别为260g/L和5g/L。2.2.3温度和时间对浊点萃取的影响考察了平衡温度(50~100℃)和平衡时间(10~60min)对浊点萃取的影响,结果表明,在70℃水浴中平衡30min,回收率最大。温度过高,胶束相中共萃物增多;平衡时间过长对回收率无显著影响。2.3标准曲线及检出限按照实验方法,对三聚氰胺的定量范围和标准曲线进行了检测,结果表明被测物的质量浓度为0.4~80mg/L时具有良好的线性关系, 其回归方程为y=431841x+6924.40(y表示峰面积;x表示样品的质量浓度,单位为mg/L),相关系数r=0.9998,以信噪比为3确定检出限为0.9mg/kg。在样品中分别添加3种质量浓度的三聚氰胺,计算添加回收率,结