全基因表达谱在子宫内膜容受中的应用

全基因表达谱在子宫内膜容受中的应用

子宫内膜的容受是指子宫内膜位于允许定位、粘合和渗透的空间，改变膜间质，并将胚胎放入床上。该过程依赖于胚胎与子宫内膜同步发育,同时包含了多种精密而复杂的调控机制。近年来基因芯片(DNA芯片、DNA微阵列)技术,是在生物信息学指导下,结合杂交技术、精密扫描技术以及计算机软件分析,最终实现对靶基因的存在、含量及变异等信息的快速检测。它具有高通量、高速度、高灵敏度、高精确度的特点,可对多个基因甚至全基因组进行快速、全自动及多参数同步分析。子宫内膜自身的接受状态和胚胎-子宫内膜的相互作用过程为胚胎着床的关键环节,也是生殖与避孕研究的焦点,本文对两个环节的基因表达谱研究进展综述如下。1子宫内膜自我接受能力的遗传因素1.1植入格局对多态性精子内皮的基因文库是否有效检测Kao等通过对植入窗口期(LH+8～10)与增殖晚期(d8～10)活检标本全基因表达谱进行了比较分析,发现有156个基因上调而377个基因下调2倍以上。上调基因包括载脂蛋白、磷脂酶A2、mammaglobin、骨桥蛋白(osteopontin)、glycodelin、N-乙酰-6-硫转移酶、b-TGF信号传导途径成员、IGF系统、Wnt信号传导途径成员、多种免疫调节子、抗菌调节子及金属硫蛋白等。下调基因包括肠三叶草因子、tenascinC、matrilysin(matrixmetalloproteinase-7)、卷曲相关蛋白(FRP-HE和Wnt抑制子)等。Borthwick等对植入窗口期(LH+6～8)与增殖晚期(d9～11)标本全基因表达谱进行了分析,试验方法稍有不同,将样本RNA杂交到芯片之前汇集混合,而Kao等是将单个体子宫内膜标本RNA分别杂交到芯片上获得个体资料后再将资料汇总分析。Borthwick等发现有90个基因上调而46个基因下调2倍以上,其中许多基因和KAO等报道一致。Carson等使用Affymetrix芯片研究比较了黄体中期(容受期LH+6～8天)与黄体早期(容受前期LH+2～4)的子宫内膜基因表达,发现323个基因上调而370个基因下调2倍以上。许多调节基因与Kao等报道相同,这些基因20%编码细胞表面受体、黏附因子、ECM蛋白和生长因子等。Riesewijk等也进行了相似研究,采集设定了严格的取样日期,且活检样本来自同一个个体LH+2和LH+7的子宫内膜,报道有153个基因上调,而58个基因下调3倍以上。其中约1/3的上调基因与KAO资料一致,而与CARSON相同的仅10%。Mirkin等采用不同的对照个体,严格取样日期的程序,分析了植入窗口期(LH+3)和增殖晚期(LH+8)的子宫内膜标本,结果有90个基因上调而46个下调2倍以上,其中45个基因为新发现的植入关联基因。同一课题研究使用同一种芯片进行,却有不同结论,可能存在以下原因:①由于芯片价格昂贵,每项研究受试者仅3～10人,且研究对象的年龄、孕产史、生活环境存在较大差异。Riesewijk等为了避免上述差异,采用个体自身对照,但Mirkin等认为此举有涉嫌两次活检造成子宫内膜炎性状态。②取材时间存在差异。③标本成批检测与各自单独检测的差异。④设定的判断域值存在差异,造成假阴性和假阳性结果。⑤芯片检测的系统误差以及无法克服表达差异。尽管报道存在分歧,且每篇报道都有新的发现和矛盾,但目前采用Affymetrix公司芯片最完整的5份研究中,共同认定的植入窗口期标志性基因见表1。1.2基因组织及基因家族的调节作用检测在人胚胎植入过程中,胎盘滋养层可侵入母体子宫内膜基质细胞部分,而基质细胞脱膜化对胚胎成功植入是必不可少的,基质细胞分化具有明显的形态特征和特有的生物合成及分泌表型。排卵周期分泌晚期不论受孕与否,基质细胞脱膜化开始独立进行。Popovici等于2000年首次采用DNA芯片技术体外检测人子宫内膜基质细胞的分化,雌二醇(E2)和黄体酮用药后10天,1mmol/L8-溴-cAMP用药48小时,比较分离后脱膜化的子宫内膜基质细胞与非脱膜化对照组基质细胞的基因表达,发现胰岛素受体、神经递质受体、神经调质、促卵泡生成素(FSH)受体、抑制素-激活素Ba亚单位、α抑制素、血管紧张素-肾素家族的部分成员以及肿瘤坏死因子相关的凋亡均可诱导配体表达上调,同时还发现了上调特异性细胞因子、生长因子、核转录因子、细胞周期因子家族成员和cAMP信号传导成员等新的分化成员,证实了脱膜化过程中的许多作用因子,尤其是b转化生长因子(TGF-b)家族新成员在脱膜化过程中的上调,神经调质和神经递质受体的表达和许多免疫成分的表达,其中许多成员是新发现的。随后,有两个研究组对基质细胞脱膜化进行了更大规模的研究,其中Brar等研究了近7000个基因的时间特异性表达和调控。用E2、黄体酮和8-溴-cAMP处理人蜕膜的纤维原细胞,在0、2、4、6、9、12和15天检测基因的表达,分析6918个基因,其中121个基因诱导表达水平增加2倍以上,110个基因表达下调,并有50个双向变化。这些动态调控基因按照发挥功能的时间归类为9种基因表达模式,基因被分为以下几类:细胞和组织功能、细胞和组织结构、基因表达与调控、EST序列和功能未知类。作者发现蜕膜纤维原细胞脱膜化过程中,下列蛋白发生了明显变化:涉及细胞外结构、细胞骨架和细胞黏附蛋白、转录因子、IGF家族成员、有丝分裂激活蛋白激酶信号传导相关的早期诱导蛋白等。这些发现提示,在脱膜化过程中同时存在多个作用体系。许多基因在特定的功能组中表达会发生改变,相关功能中基因家族同时发生诱导和表达下调。在另外研究中,Tierney等使用Affymetrix的高通量寡芯片,体外研究经8-溴-cAMP处理0、2、4、6、12、24和48小时后,人子宫内膜基质细胞脱膜化的基因表达,也发现脱膜化过程中基因和基因家族表达的改变,这种改变与子宫内膜分泌型的转化一致。两个研究小组共同认定的上调或下调基因,可能均参与了脱膜化过程。但在体外细胞培养的基因表达结果并不一定与体内组织状况一致。两个研究都证实在基质脱膜化时间进程中基因表达的改变,以及在基质细胞分化到脱膜化表型过程中多种作用过程的并存,揭示了在子宫内膜周期和脱膜化中基质的功能时序。2子宫内和子宫内之间的相互作用2.1人类正常组织中引物合成及基因家族在体细胞内表达情况的改变Cowan等使用绒毛癌BeWo细胞系与子宫内膜基质细胞共培养模型,采用差异展示PCR方法,研究胚胎滋养层与子宫内膜相互作用,发现在BeWo细胞刺激过程中基因表达差异,基质细胞与BeWo细胞体外共培养4小时后,Soares基因在脱膜化细胞中表达上调,该基因同样在Tierney等基质细胞脱膜化研究中得到证实,结果表明胚胎滋养层可能加速基质细胞的脱膜化,提示胚胎滋养层对子宫内膜的容受性有重要影响。Aronow等体外研究细胞滋养层到合胞滋养层基因的变化,通过6天的体外培养,应用寡核苷酸微列阵发现许多基因和基因家族的程序化改变,其中141个基因表达上调,256个基因表达下调,早期表达的基因主要与胚胎向母体的侵入功能有关,合胞滋养期主要反映细胞孕期的转运功能。该研究为体内胚胎与子宫内膜相互作用的研究提供了依据。最近Popovici等使用7～9周流产胎儿胎盘细胞体外与子宫内膜基质细胞共培养建立模型,采用基因表达谱芯片检测共培养后子宫内膜基质细胞基因表达差异,发现171个基因表达上调,119个基因表达下调,并对其中MMP-11、TIMP3、DKK-1、IGFBP-1、PTX3、RPL19、FGF-1SOX4、IL-8基因进行PCR定量印证。Chen等采用DNA芯片分析了人类早孕期的蜕膜和绒毛,发现641个基因在蜕膜和绒毛组织均大量表达,这些基因可能参与了胎盘和脱膜间的相互作用。49个基因在脱膜中特异上调,包括接合组织生长因子、IGFBP-1、IGFBP-4、cathespinL、IL-1I型受体、胰岛素受体、S-100钙结合蛋白等,上述结论与他人研究一致。75个基因在绒毛特异表达,包括抑制素Ba亚单位、stromelysin-3、糖蛋白a链前体、生长激素变体、白血病抑制因子受体和其他细胞生长周期调节因子、凋亡相关因子、激素、细胞因子、应激效应因子、信号转导因子。这些研究有利于揭示早期胚胎和蜕膜相互作用时序和基因动态变化。2.2不同植入点间的基因表达差异胚胎的植入是局部子宫内膜的短暂系列反应,除了掌握子宫的整体容受状态外,了解胚胎与子宫局部的识别融合机制,是对子宫内膜容受性更深入直接的探索,但鉴于取材困难,研究只能用动物实验。根据小鼠生殖规律,植入发生在第4天(阴栓日为第0天)。Yoshioka等用寡核苷酸微列阵研究了胚胎植入前(第3.5天)和胚胎植入后(第5.0天)基因表达差异,发现在此进程中192个基因上调,207个基因下调。因为第5天时脱膜化明显增强,故这些基因多代表脱膜化,而非植入特异基因。许多基因变化与Cheon等报道黄体酮基因调节一致。Reese等用微列阵方法,分别在小鼠胚胎植入点和非植入点、黄体酮处理的延迟植入期和雌激素终止处理后的基因表达差异,结果发现在胚胎植入点36个基因上调和27个基因下调,在黄体酮延迟植入期128基因上调和101基因下调。综合分析发现,27个涉及细胞分化功能的基因在植入点和子宫激活期同时上调。而下调的基因大多涉及宿主的免疫反应,说明这些基因在调节子宫对滋养胚植入环境的重要性。Salamonsen等采用差异显示PCR研究发现,剪接因子SC35、钙结合蛋白D9k、单克隆非特异抑制因子(MNSF-B)表达差异。SC35主要作用于从mRNA前体中去除内含子在植入点上调,相反,虽然黄体酮使上皮细胞表达上调,但在孕4.5～5.5天植入点却表达明显较低,免疫调节因子MNSF-B在植入期表现明显下调,上述结果与Reese等报道一致。更令人振奋的是Luu等利用了这一成果,通过阻断钙结合蛋白成功地在小鼠体内达到阻断植入的“避孕”效果。胚胎成功植入的进程,需要胚胎和子宫内膜同步发育,发生在特定的微环境状态,需要特定的时空及方式。现有的研究仅证实了该进程的框架。研究胚胎与子宫内膜相互作用,虽然基于植入窗口期子宫内膜的基因表达,但人子宫内膜活检标本只代表没有胚胎影响下的一个时间点样本,不能反映出胚胎植入过程中胚胎与子宫内膜间的动态交流过程。揭示了植入窗口期的一些分子通路、分子信号和生理进程,动物实验为我们提供可控的环境和