反相高效液相色谱法测定护肝片五味子乙素的含量

反相高效液相色谱法测定护肝片五味子乙素的含量

肝屏障是由柴胡、艾哈巴、板蓝根、五味子、猪胆粉和绿茶组成的6种中药组成的片剂。它具有保护肝脏、降低丙氨酸氨基转移酶的作用，适用于急性肝炎、肝炎、丙氨酸铵转氨酶诱导和药物的联合疾病。其质量标准收载于《中国药典》2000版一部,含量测定前处理比较麻烦,《中国药典》2005版一部改为控制其五味子醇甲的含量。笔者参考有关文献建立的反相高效液相色谱法采用外标法测定五味子乙素的含量,本法简便、结果可靠,可以作为护肝片的质量控制。1仪器和试剂盒1.1基于rs296pda的两相检测方法600E型高效液相色谱仪(包括Waters2996PDA二极管阵列检测器和Empower工作站);ShimadzuUV-2201紫外分光光度计。1.2品化学品检定所五味子乙素对照品(含量测定用,中国药品生物制品检定所,批号为110765-200407);护肝片(市售);甲醇为色谱纯(Merck),水为纯化水。2方法和结果2.1流动相、检测波长色谱柱:SinochromC18色谱柱(200mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-水(72∶28);流速:1.0mL·min-1;检测波长:254nm;进样量:20μL;柱温:30℃。五味子乙素的保留时间约为31.332min。理论板数n不低于4000。对照品、样品和阴性对照色谱图(见图1)。2.2溶液的制备2.2.1对照溶液的制备精密称取五味子乙素对照品适量,加甲醇制成浓度约为50μg·mL-1的溶液,即得对照品溶液。2.2.2供试品溶液制备取本品20片,除去包衣,精密称定,研细,称取2.5g,精密称定,加乙酸乙酯50mL,水浴回流60min,滤过,水浴蒸干,残渣用甲醇微热使溶解,移至25mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液。2.2.3准分离溶液的制备按处方比例依据护肝片制备工艺制备不含五味子的阴性对照样品,依2.2.2项下方法操作,得缺五味子阴性对照溶液,备用。2.3标准曲线及方法标准曲线精密称取五味子乙素对照品10.21mg,置100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。精密量取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0mL分别置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,取此9个浓度的对照液与对照品贮备液分别进样20μL,测得峰面积,回归方程为A=1.08210×105C+10862,r=0.9996。表明五味子乙素在10.21～102.10μg·mL-1范围内线性良好。2.4rsd测定精密量取2.2.1项下对照品贮备液1mL,置于10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,取20μL注入液相色谱仪,重复进样6次,记录峰面积,结果RSD为0.97%。2.5重复试验取同一批号样品按2.2.2项下方法平行制备6份样品溶液,按上述色谱条件分别测定,记录色谱图,RSD为0.89%。2.6样样的制备精密称取已知含量的样品粉末适量(约1.25g),精密加入五味子乙素对照品溶液(0.1021mg·mL-1)9mL,照2.2.2项下方法平行制备6份样品溶液,按上述色谱条件分别测定,记录色谱图。计算回收率及RSD。测定结果(见表1)。2.7味子乙素的测定取同一样品溶液,于0、1、2、4、8、12、16、20、24h分别进行测定,结果表明:24h内基本稳定,五味子乙素的RSD为1.20%。2.8样品含量的测量取3个不同批号的样品,照2.2.2项下方法处理、进样、记录色谱图,按外标法计算含量结果(见表2)。3检测波长的选择3.1五味子乙素易溶于乙酸乙酯,故采用乙酸乙酯作为提取溶剂,回流的提取效果优于超声。3.2取五味子乙素对照品适量,配制成50μg·mL-1,在波长400nm～190nm范围内进行紫外扫描,在254nm波长处五味子乙素有最大吸收,并参考有关文献,故选择254nm作为检测波长,以提高检测准确度。3.3本文采用高效液相色谱