高效液相色谱法测定大鼠血浆中黄体酮的浓度

高效液相色谱法测定大鼠血浆中黄体酮的浓度

黄体酮是临床上常用的酪氨酸酶之一。主要用于月经疾病、功能性子宫出血、黄土机制不全引起的早发性生殖器和正常流产。天然的黄体酮口服给药由于肝脏的首过效应生物利用度很低。为了维持血浆中有效的血药浓度,口服需要多次给药。近年来,脂质纳米粒由于具有很好的生物相容性和较高的生物利用度受到关注。黄体酮为脂溶性药物,能有效包裹于脂质纳米粒中,因此可以将其制备成脂质纳米粒,以提高其生物利用度。为探索黄体酮脂质纳米粒的药动学特征,本试验建立了黄体酮的血药浓度HPLC测定法,并对黄体酮脂质纳米粒经大鼠口服给药后的生物利用度进行了研究。1黄体酮和达那唑Agilent1100高效液相色谱仪(安捷伦公司);3K30高速离心机(Sigma公司);FA1104电子天平(上海天平仪器厂)。黄体酮脂质纳米粒(由浙江大学药学院自制);黄体酮对照品(浙江仙居制药股份有限公司);达那唑(浙江仙居制药股份有限公司);甲醇和其他试剂均为色谱纯。SD大鼠雄性,浙江大学医学院动物中心提供,合格证号SYXK(浙2004-0052)。2方法和结果2.1流动相、检测波长色谱柱:HypersilC18柱(150mm×3.9mm,5μm);流动相:甲醇∶水(60∶40);流速0.6μg/ml;检测波长:240nm;柱温:40℃;进样量:50μl。2.2成工作液5.精密称取黄体酮对照品10.00mg,加甲醇溶解,使成1mg/ml的储备液。精密吸取该贮备液1ml,加甲醇稀释,使成工作液(100μg/ml),置4℃冷藏备用。称取达那唑10.00mg,加甲醇溶解,使成1mg/ml的储备液,作为内标,4℃冰箱内保存。2.3酶处理法精密移取血浆样品200μl,加入内标溶液20μl,用乙酸乙酯1.00ml提取,涡旋3min,离心(4000r/min,10min),精密吸取上清液0.7ml,在45℃水浴下高纯度氮气吹干,残余物用100μl流动相溶解,漩涡混合2min,4000r/min离心10min,取上清液进样测定。2.4所得谱图的分析取空白血浆和供试血浆,按“2.3”项下处理,进样,所得谱图见图1。可见在上述色谱条件下,黄体酮和内标有较好的分离度,空白血浆中的内源性杂质对黄体酮和内标的分析无干扰,因此本法具有较好的专属性。2.5黄体酮浓度线性回归用空白血浆将黄体酮标准溶液稀释成相当于血药浓度为0.02、0.5、0.1、0.2、1、2μg/ml的系列浓度标准血浆,按“2.3”项下操作,以(A/A内)-(A空/A内)(其中A空为空白血浆中的黄体酮)对黄体酮浓度进行线性回归。结果黄体酮在0.02~2μg/ml浓度范围内线性关系良好,回归方程为:Y=1.993X-0.0456(r=0.9999,n=3),定量限为(0.02±0.004)μg/ml(n=3),最低检测限为0.005μg/ml(S/N≥3)。2.6黄体酮回收率测定结果用空白血浆将黄体酮稀释成相当于血药浓度为0.02、0.2、2μg/ml的3种质控血浆,按“2.3”项处理后测定,以相同浓度纯溶剂配制的对照品的色谱峰面积为参比,计算绝对回收率;以标准曲线计算方法回收率,结果见表1。按照同样的方法测定内标的绝对回收率为88.3%,与黄体酮的绝对回收率相近,符合要求。再按此方法考察黄体酮的日内(每日测定6次)、日间精密度(测定6d,每天1次),结果均小于10%,符合生物样品测定的要求。2.7稳定性试验2.7.1黄体酮含量测定血药浓度为0.02、0.2、2μg/ml的3种质控血浆,按“2.3”项下方法处理后,分别于0、4、8、l2和24h测定黄体酮含量,结果各浓度的回收率在98.3%~105.4%,表明样品在24h内稳定。2.7.2冻融稳定性测定:样品在冷冻保存后反复导致的稳定性测定,样品在冷冻融后稳定性良好。经过冻融后人0.02、0.2、2μg/ml3种质控血浆即时测定,再冷冻保存24h后,在室温条件下解冻后测定,连续测定3次,结果各浓度的回收率为95.76%~103.5%,表明样品经过冻融后的稳定性良好。2.7.3黄体酮冷冻保存稳定性试验0.02、0.2、2μg/ml3种质控血浆即时测定,于-20℃冷冻保存15d后再次测定,各浓度的回收率为94.55%~106.3%,表明黄体酮冷冻保存15d内稳定性良好。2.8动物实验2.8.1大鼠sd大鼠卵巢内固定术为消除动物本身激素水平对实验结果的影响,实验以去势大鼠作为模型动物。取体重约200g的雌性SD大鼠,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,固定,于下肢腹股沟位腹中线纵向切开约1cm的切口,以手术线靠近卵巢处结扎所连接的输卵管,取出卵巢,将输卵管放回到原来的方位,缝合切口,继续饲养三周后使用。2.8.2生物利用度检测取去势大鼠18只,随机分为3组,实验前禁食12h。以2mg/100g的剂量分别灌胃给予黄体酮脂质纳米粒和黄体酮油溶液(剂量为3mg/100g,作为对照),于给药前及给药后0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36h从尾静脉取血0.5ml,肝素抗凝,4000r/min离心后取血浆。精密吸取血浆样品200μl,按“2.3”项下方法处理,测定药物含量。依据(1)式计算脂质纳米粒相对于油溶液的生物利用度。相对生物利用度Frel=(AUCT×DR)/(ATUR×DT)×100%(1)其中T与R分别为受试制剂与参比制剂,D为给药剂量。黄体酮油溶液和黄体酮脂质纳米粒口服给药后,血药浓度-时间曲线见图2。由图可见血药浓度有两个峰值,前一个峰纳米制剂和对照溶液都出现在1~3h内;而后一个峰纳米制剂给药出现的相对较晚,在6~12h内,而对照溶液的峰值在4~8h内。根据梯形法计算得到黄体酮脂质纳米粒和对照油溶液的AUC0~36h分别为7.2656和5.6387μg/h/L,黄体酮脂质纳米粒的生物利用度为对照油溶液的1.93倍。3黄体酮含量测定实验结果在黄体酮的提取溶剂的选择中,我们比较了乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚,发现三氯甲烷和二氯甲烷对黄体酮提取率非常低,乙醚对黄体酮的提取率比较低,而乙酸乙酯具有理想的提取率,干扰少,峰形尖锐、对称,两峰分离度良好,故选择乙酸乙酯作为提取溶剂。在寻找内标的过程中,我们试验了多种化合物,发现在本实验条件下,达那唑除了保留时间合适,与黄体酮的分离度较好外,其稳定性也非常好,故选用达那唑做内标。为消除大量存在的内源性黄体酮对测定的干扰,本研究选用去势大鼠为模型动物,测定结果发现,空白血浆中还有少量的内源性黄体酮存在,但含量相对恒定,6份空白血浆中的黄体酮含量的RSD为3.23%,可以认为生理性的黄体酮不影响外源性黄体酮的测定。有报道使用放射免疫法测定血浆中黄体酮的含量,但是因为价格昂贵,不适合大部分实验室的应用研究。而本实验建立的HPLC法,测定大鼠血浆中黄体酮的含量的方法成本低,具有简单、快速、灵敏等特点,适用于黄体酮纳米制剂口服给药后的血浆中药物含量的测定。通过测定大鼠血浆药物浓度发现,黄体酮脂质纳米粒和对照溶液都可以在胃肠道内较快被吸收进入体循环。可能由于肝肠循环的作用,两种制剂给药后均出现了第二个峰。但脂质纳米粒给药的第二个峰浓度较油溶液更高,且延续时间更长,这个现象与我们以往的研究结果类似,即脂质