蚯蚓提取物地龙2号对实验性大鼠肝纤维化的影响

蚯蚓提取物地龙2号对实验性大鼠肝纤维化的影响

肝纤维是指肝脏中的纤维生成超过分解的，以及特定细胞（ecm）在肝脏中积聚过度积聚引起的肝脏纤维生成。大量研究表明胶原酶、纤溶酶等参与了ECM的降解。地龙2号是采用生物工程技术从中药地龙中提取的有效活性成分,主要含有蚯蚓纤溶酶及蚯蚓胶原酶。既往研究发现地龙2号可以抑制CCl4诱导的大鼠肝内纤维组织的形成,减轻肝细胞的损害,降低血中透明质酸及层粘连蛋白的含量,具有抗肝纤维化作用。本研究旨在探讨地龙2号对大鼠肝纤维化形成过程中肝组织内α肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGFβ1)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及Ⅰ型纤溶酶原激活抑制物(PAI-1)蛋白表达的影响,以探讨其抗大鼠肝纤维化的机理。材料和方法一、材料表面动物为雄性Wistar大鼠,体重(160±10)g,购自河南医科大学实验动物中心。二、方法1.模型的制作52只大鼠随机分成6组:正常组(N,6只);模型组(M,10只):40%CCl4与花生油混合液0.02ml/kg背部皮下注射(首剂为75%CCl4花生油混合液0.05ml/kg),每周2次,单蒸水灌胃10ml·kg-1·d-1;阴性对照组(NC,6只),花生油皮下注射,单蒸水灌胃,量及用法同模型组;阳性对照组(PC,10只):秋水仙碱0.1mg·kg-1·d-1灌胃,单蒸水配制;地龙2号大剂量组(Eh,10只):地龙2号50mg·kg-1·d-1灌胃,单蒸水配制;地龙2号小剂量组(El,10只),地龙2号25mg·kg-1·d-1灌胃,单蒸水配制,PC、Eh及El组CCl4造模方法同M组。所有药物均现配现用,每只大鼠用药前均称体重。存活大鼠均于第8周末处死,分别切除同一解剖部位的肝脏于10%中性缓冲福尔马林液中固定,石蜡包埋。2.upa及pai-1多克隆抗体按SP试剂盒(福州迈新公司)操作说明,兔抗大鼠α-SMA、TGFβ1、uPA及PAI-1多克隆抗体(武汉博士德公司),工作浓度分别为1∶150、1∶100、1∶50及1∶50。每次染色均采用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照,在光镜下观察,阳性反应呈棕黄色。3.显色指数的计算参照免疫组化显色标准略修改:每张切片均由二位病理科主任医师分别观察5个显色较好的高倍镜视野,分别记录显色程度和显色范围。显色程度分弱、中、强,用(+)、(++)、(+++)记录;显色范围占高倍视野<1/4时记录为(+)、～2/4为(++)、～3/4为(+++)、>3/4为(++++)。然后按以下公式计算。显色指数=显色程度×显色范围(+、++、+++、++++分别按1、2、3、4分计算)。二位医师的检查结果取均数为每一种蛋白表达的最终显色指数。三、统计分析方法计量资料以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,用SPS10.0软件包统计分析,两组间差异用单因素方差分析,相关性研究采用Spearman等级相关分析,P<0.05为差异有显著意义。mt组不同部位显色指数tgf1和pai-1的表达N及NC组血管壁可见少量α-SMA阳性表达;M组α-SMA阳性表达细胞数明显增多,主要分布于门静脉、汇管区、纤维间隔和邻近的肝窦;Eh及El组较M组显色指数显著降低,(P<0.01)(表1,见封三图1、2)。N及NC组TGFβ1表达极低;M组TGFβ1在汇管区和纤维隔中染色明显加深;Eh及El组于上述部位显色指数明显减轻(P<0.01)(表1,见封三图3、4)。N及NC组uPA表达极低;M组uPA在汇管区和纤维隔中染色明显加深,主要见于肝脏星状细胞胞浆中,呈强阳性表达;与M组相比,Eh及El组显色指数减轻(P<0.05)(表1,见封三图5、6)。N及NC组PAI-1表达很低;M组于汇管区、纤维间隔、血管和胆管细胞及肝窦可见大量PAI-1阳性染色,且与上述部位毗邻的肝细胞浆内亦可见棕黄色染色;与M组相比,Eh及El组显色指数降低(P<0.05)(表1,见封三图7、8)。不同药物干预对肝纤维化大鼠肝脏中-sma和tgf1的表达肝星状细胞(HSC)在肝纤维化时可发生表现型改变,称为“活化”。受HSC调控的ECM的产生与降解失平衡,是各种病因肝纤维化发生的共同中心环节。激活的HSC可分泌多种细胞因子,其中TGFβ1是最关键的致纤维化因子。激活的HSC不仅能够自身分泌TGFβ1,且后者与受体的结合能力也明显增加,这种自分泌正反馈调节是肝纤维化得以发展的重要环节。本实验中,未发生肝纤维化的N组及NC组中α-SMA与TGFβ1表达很少甚至不表达;已发生肝纤维化的模型组中α-SMA与TGFβ1表达都明显升高,多见于汇管区和纤维隔中,肝血窦中也明显可见;而应用地龙2号后α-SMA与TGFβ1的表达有显著减轻。由于α-SMA是HSC激活的标志,且TGFβ1由活化的HSC产生,TGFβ1的表达升高与肝纤维化的程度有正相关关系,所以我们推测地龙2号可能通过抑制HSC的活化、降低TGFβ1的表达而减轻肝纤维化。近年来研究表明,u-PA对HSC有直接促有丝分裂的作用,抑制u-PA的表达可以降低HSC的活性,从而延缓纤维化的发生发展。HSC激活后使PAI-1增加,抑制纤溶酶原的激活,PAI-1也能降低基质金属蛋白酶的活力,结果使ECM的降解减少。本实验研究表明,用CCl4造模8周后,已发生肝纤维化的模型组中uPA及PAI-1在汇管区和纤维间隔中染色明显加深,胆管细胞及肝窦亦可见大量PAI-1表达,而且与α-SMA及TGFβ1表达部位相同,与α-SMA及TGFβ1的表达升高也有明显的正相关关系;用地龙2号药物干预后,肝纤维化大鼠肝脏的uPA及PAI-1表达