培养条件对大肠杆菌的生长

培养条件对大肠杆菌的生长摘要大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）是微生物学和遗传学常用的实验材料，为单细胞原核生物，宽约0.5×1～3微米；具有由肽聚糖组成的细胞壁；周身具鞭毛，能运动。大肠杆菌是在人和动物肠道中生活的、不会致病的正常栖居菌，但若进入胆囊、膀胱等处也会引起炎症。它能利用多种糖类物质产酸、产气，其代谢类型为异养兼性厌氧型；其代谢活动能产生大肠杆菌素（抑制肠道内其他分解蛋白质的微生物生长），还能合成维生素B和K。它们在肠道中大量繁殖，几乎占粪便干重的1/3。实验室中用于培养微生物的营养物质称为培养基。按培养基的物理状态可分为：液体培养基和固体培养基。将已知的菌种引入新配制的培养基的过程称为接种。而在固体培养基表面用蘸有菌种的接种环连续划线，既可以达到接种的目的，又可以实现分离菌种的目的。这是因为划线过程中接种环与培养基表面接触，接种环上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分细菌间的距离加大，经过培养后可出现由单个细菌细胞形成单菌落，这样就达到了分离细菌的目的。关键词：培养条件；大肠杆菌；生长目录1前言 前言大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)为革兰氏阴性短杆菌，又称肠埃希氏菌。大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢。主要生活在大肠内。大肠杆菌革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可认为是寄生。它的基因组DNA为拟核中的一个环状分子。同时可以有多个环状质粒DNA。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料。大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。大肠杆菌细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。作为外源基因表达的宿主，大肠杆菌遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，繁殖迅速，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系，是生物学上重要的实验材料。实验室中用于培养微生物的营养物质称为培养基。按培养基的物理状态可分为：液体培养基和固体培养基。将已知的菌种引入新配制的培养基的过程称为接种。而在固体培养基表面用蘸有菌种的接种环连续划线，既可以达到接种的目的，又可以实现分离菌种的目的。这是因为划线过程中接种环与培养基表面接触，接种环上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分细菌间的距离加大，经过培养后可出现由单个细菌细胞形成单菌落，这样就达到了分离细菌的目的。2材料与方法2.1菌种处于安全考虑，工业生产用的菌株是在生物工程技术不断筛选后被挑选出的菌株。这些菌株失去了细胞壁的重要组分，在自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。这样，即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。发酵用菌种的筛选:用LB液体培养基铺平皿,接种,30℃培养18h,挑单菌落接种于含5mlLB培养基(50μg/ml氨卞西林钠)的试管中,30℃培养至OD600nm为0.4-0.6,升温至42℃,培养3h,离心收集菌体,SDS检测,选取表达量最高的克隆菌作为发酵用菌种。基因工程菌为大肠杆菌DH5α/pBV220。2.2试剂氯化钠、氢氧化钠、工业消泡剂、甘油、硫酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、无水硫酸镁、酵母粉和蛋白胨、琼脂等。2.3培养基及组成成分添加发酵大肠杆菌所需培养基包括种子罐培养基,发酵罐培养基（以种子培养基为基质,再添加适量营养成分、无机盐和微量元素）。微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。每1L配制好的微量元素溶液中含有FeCl3·6H2O3.24g,ZnCl20.22g,CoCl2·6H2O0.24g,NaMoO4·2H2O0.24g,CaCl2·2H2O0.12g,CuSO4·5H2O0.20g,H3BO31.00g,MgSO40.74g及62mLw=38%的盐酸溶液。取130μL上述微量元素溶液及4μL25g/L的维生素溶液,将其一起加入到100mL的培养基中。2.4培养方法从菌种选择方面进行研究。工业生产用的菌株是在生物工程技术不断筛选后被挑选出的菌株。选取表达量最高的克隆菌作为发酵用菌种，基因工程菌为大肠杆菌DH5α/pBV220。一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌。准确称取各成分。配置LB固体培养基时还需要加入琼脂。在250ml三角瓶和500ml三角瓶中分别装入30ml和230mlLB液体培养基。将三角瓶用6层纱布包住瓶口，再用牛皮纸包好，放入灭菌柜内，121℃液体程序灭菌20min。2.4.1种子罐培养将一级种子接种于10L种子罐培养基(含Amp0.1g/mL)中，通气量为50L/min,搅拌速度为200-1000r/min,当培养至菌体光密度达到所需要求时,升温至42℃,诱导表达一定时间。发酵中加入一定比例的工业消泡剂消除泡沫，以防泡沫过多，影响发酵。在接种前取样一次,并将此样品作为比色测定的参比溶液。接种后每隔30min取样一次,测菌体光密度,最后取2mL发酵终止液进行离心,测定菌体光密度、菌体湿重、菌体干重和rhG-CSF的表达量。2.4.2摇瓶发酵将在-70℃的甘油管中冻存的基因工程菌（大肠杆菌）菌种接种于装有LB液体培养基的250ml三角瓶中,所有培养基均含氨苄西林钠(Amp)0.1g/mL。将培养液在37.5℃,200r/min的摇床条件下培养17-18小时,取出，放于洁净密闭工作台中。手消毒后点燃酒精灯，于工作台中吸取2mL菌液，再接种于装有230mlLB液体培养基的500mL三角瓶中。将培养液放入摇床中培养，培养至菌体光密度达到所需要求后,将其作为一级种子。3培养条件对工程菌的生长影响3.1实验数据3.1.1溶解氧的测定按照4％接种量接人液体大肠杆菌种子液，37.5℃，200r／min，在pH7.5的培养基中培养，并以不同的通气量，使溶氧指数达到20％、30％、40％、50％、60％、70%，18h后取菌液测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.1.2培养温度的测定在LB液体培养基中，按4％的接种量，30～40℃，200r／min，溶氧量50％，在pH7.5的培养基中培养18h，取菌液测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.1.3接种量的测定按照不同的接种量1％、2％、3％、4％、5％，接种于10L发酵罐中，在37.5℃，200r／min，溶氧量50％，pH7.5的培养基中培养，18h取菌液测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.1.4pH值的测定以35mol／L的Na2HPO4-NaH2PO4为缓冲液，将培养基分别调至pH6.0～8.5，4％的接种量，37.5℃，200r／min，溶氧量50％，培养18h后测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.1.5转速的测定按4％接种量接入含LB培养基的10L发酵罐中，在100～300r／min，自动控制pH7.5，溶氧量50％，pH7.5的培养基中培养，37.5℃培养18h后测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.1.6培养时间的测定按4％接种量接入含LB培养基的10L发酵罐中，37.5℃，在培养过程中自动控制pH7.5，溶氧量50％，200r／min，培养10h后每隔2h测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.1.7工程菌的生长时间及诱导时机在选定的发酵罐培养条件下,将种子液接种于发酵培养基中,测定工程菌在37.5℃时的生长曲线，观察工程菌生长和rhG-CSF的表达。实验同时还比较不同的诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响。3.2结果与分析3.2.1溶氧量对菌体生长的影响溶氧量的优化根据发酵罐中不同的溶氧指数，得到培养18h时发酵体系的菌体密度。结果表明，菌体密度随着在溶氧指数的增加而不断增加，但在50％以后菌体密度增加缓慢。3.2.2培养温度对菌体生长的影响培养温度优化在35～40℃范围内菌体密度随温度的升高而升高，这符合大肠杆菌的生长特性。但在37～38℃时增长速度较快，随后的增长比较平缓。结合大肠杆菌的一般培养特性和温度与其他影响因素间的交叉影响，本试验中设定培养温度为37.5℃。3.2.3接种量对菌体生长的影响接种量的优化不同的接种量可以对细菌的生长产生较大影响，3％～4％时，细菌的生长状态优于过低或高的接种量，过低的接种量会使菌体生长过慢而过高的接种量会使营养物质早期大量消耗，并且会造成种子菌株的浪费。所以本试验中采用4％的接种量。3.2.4pH值对菌体生长的影响pH值优化利用不同pH值的培养基对大肠杆菌培养18h后，结果显示。pH值在8.0时对菌体密度没有很大影响，而pH值过低或过高均达不到良好的效果。pH值在7.5时所得到的菌体密度相对最高，其OD600nm达到3.25。3.2.5转速对菌体生长的影响摇床转速优化随着溶氧量增大菌体密度相应提高。在100～200r／min时菌体密度增长速度较快，200～300r／min时增长相对缓慢，说明200r／min的转速已经可以促进空气中氧的溶解。考虑到转速的增加可能会产生泡沫等不利影响，所以，本试验中所采取的最佳转速为200r／min。在选定的发酵罐培养条件下,将种子液接种于发酵培养基中,测定的工程菌在37.5℃时的生长曲线如图1所示。图1工程菌间歇培养的生长曲线由图1知,接种后菌体数量并不是立即增长，而是经历了1h左右的延迟期，这可能是由于菌体为适应新的环境，诱导出了新的代谢途径。之后菌体迅速进入对数生长期，生长大约18h后菌体光密度OD600nm最高可达22.0。在对数生长末期，营养物质大多已被消耗，并且积累了抑制菌体生长的代谢产物，培养体系中菌体数目的增长逐渐停滞，生长进入稳定期和衰亡期。实验同时还比较了不同的诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响(表1)。表1诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响诱导时机D600菌体光密度D600菌体干重/(g•L-1)rhG-CSF表达量/%1.044.763.0923.52.077.775.5727.92.528.465.5829.33.1210.926.2530.43.4810.926.1535.94.4111.346.7137.75.0612.396.8930.9综合考虑菌体生物量和rhG-CSF的表达量，为使rhG-CSF的产量最高，应选择在菌体光密度OD600nm≈4.5时对菌体进行诱导，此时可得到较高的菌体干重，同时rhG-CSF的表达量也较高。3.2.6培养时间对菌体生长的影响优化不同培养时间的结果显示，12～18h细菌呈倍数增长，之后的增长缓慢。表明指数生长后期，细菌的能量已不适于大量繁殖，而是受代谢产物的影响。因此，为了缩短生长周期，细菌的收获应在指数生长后期，即18h为宜。通过试验我们得到了大肠杆菌在10L发酵罐培养的最佳营养条件和最佳环境条件。从工业要求的角度，同时在遵循药品生产质量管理规范(GMP)原则、有效利用现有的设备达到预期生产规模的前提下，将在10L发酵罐中获得的最佳发酵条件，应用于200L发酵罐进行生产试验。结果显示，大肠杆菌DH5α/pBV220经高密度发酵后的菌体浓度可以达到12.94g／L，这不仅为其规模化生产奠定了基础，也在GMP原则的指导下探索到了一套标准化的生产工艺，使大肠杆菌的发酵更简便、快捷、操作性更强，并具备进一步工业化研究的潜力。在试验中得到培养20h时细菌的密度依然呈上升趋势，并明显高于18h时，然而由于随着培养时间的延长，细菌会不断地衰老死亡，活菌比例不断减少，导致所得产物的免疫原性受到一定的影响。所以认为，在进行大肠杆菌高密度发酵时，控制培养时间在18h是比较合适的。溶解氧是影响细菌发酵的重要因素之一。溶氧指数是指测得水体的溶氧量与监测水体有相同水温和盐度时的饱和溶氧量之比。本试验采取连续流加，即补料前通过转速和通气量将溶氧控制点设定在50％。发酵后开始补料并通过控制补料、转速和通气量将溶解氧维持在50％。结果显示，将压缩空气的通气流量控制在5m／h，可以维持发酵系统50％的溶氧指数。另外，细菌快速生长期补加10％～20％的水，可以改变发酵液流变学性质，增加氧的传递、提高摄氧率，从而利于发酵进行。利用搅拌的方法可以有效加速氧的溶解，控制适宜的pH和培养基的溶氧指数。但过高的转速会产生大量的泡沫，反而会导致溶氧浓度的降低。结论目前国内外对大肠杆菌的肠毒素和内毒素的研究，以及基因工程苗的应用已相当广泛。对毒素的表达基因序列的研究测定；毒力因子的检测；耐热性肠毒素的生化及特性鉴定；毒素和菌体感染对体内生物酶活性、血液中微量元素的动力学变化，以及免疫器官中微量元素动力学研究；用表达产肠毒素的基因和粘着素基因探针技术对产肠毒素和粘着素大肠杆菌的检测；重组DNA疫苗、能产生IGA和IGM肠道菌苗的免疫学研究；基因构建技术对志贺样毒素进行表达和基因序列研究；质粒转导和抗药性的产生研究；基因位点诱导突变的研究都比较深入。对大肠杆菌病的最终研究方向是生产一种可以对大部分的大肠杆菌有免疫保护的基因工程苗，以及利用质粒转导生产人类所需的基因工程产品。参考文献[1]杨守深，曾雪花，林敏，王佳慧，曾晓菲，邱敏华，许慧婷，谢隐华，杨小燕.猪源大肠杆菌耐药性及超广谱β-内酰胺酶流行性分析[J].中国人兽共患病学报，2019，35（01）：45-50.[2]曹少谦，南楠，袁勇军，戚向阳.枯草芽孢杆菌发酵提取物对大肠杆菌的抑制作用[