利用铁离子螯合鸡肽制备肽铁螯合物的工艺优化

利用铁离子螯合鸡肽制备肽铁螯合物的工艺优化

铁是人体所必需的养分。人体中铁元素的缺乏会影响血液和碳水化合物的合成并导致准血糖症（ida）。ida是最常见的养分不足。世界上约10.30%的人缺乏铁，其中大多数是女性、儿童和老年人，这在发展中国家的比例很高。目前利用补铁剂强化食品是防治IDA的主要手段。FeSO4等非血红素铁价格低廉,但易与食物中植酸、多酚等成分形成难溶性化合物,吸收率较低并易产生内源性自由基导致细胞膜脂质过氧化。血红素铁比非血红素铁的利用率高,但最高也只达25%左右并有异味。氨基酸螯合铁在动物体内的利用率是同水平FeSO4的近2倍,研究表明氨基酸螯合盐可能以短肽的形式整体被小肠吸收,直接进入机体组织。活性肽螯合铁是以蛋白质水解产生的活性肽为原料,与铁离子络合形成的螯合物。与氨基酸相比,肽的吸收效率更高且不易饱和,例如二肽和三肽的吸收速度高于同一组份的氨基酸,其原因在于小肠粘膜上存在专门的短肽载体,从而能够以完整形式吸收。以活性肽为原料开发吸收利用率更高、生理作用更强的新型补铁剂,正成为目前国内外研究的一个热点。乌鸡(GallusgallusdomesticusBrisson),又名乌骨鸡,具有补气养血的营养滋补作用。我们前期通过复合酶解等手段制备乌鸡低聚肽,其中分子质量分布在140~500Da之间的短肽高达75.70%,多为易被人体直接吸收的二肽、三肽,体外检测表明具有较高的抗氧化活性。以此为基础,利用乌鸡肽螯合铁将可以协同生物活性肽的免疫调节、抗氧化和促进矿物质吸收功能,多方面强化乌鸡补铁的功效。因此,本文采用来源于中国特有鸡种乌鸡的低聚肽作为原料,以FeCl2作为铁源研究了制备乌鸡肽铁螯合物的最优工艺,并通过红外光谱分析确定了螯合结构,为新型活性肽补铁剂的开发以及乌鸡资源的利用奠定基础。1材料和方法1.1仪器和检测方法乌鸡低聚肽干粉(批号WS0812-081204),由北京中食海氏生物技术有限公司提供;FeCl2、邻二氮菲、HCl、NaOH、抗坏血酸、无水乙醇均为分析纯。电子天平(FA2004N);恒温箱(LRH-99-250),上海一恒科技有限公司;离心机(CD4-2),北京医用离心机厂;pH计(SJ-3F型),上海精密仪器有限公司;超声波细胞粉碎机(JAC-Ⅳ型),济宁市奥波超声波电气有限公司;紫外可见分光光度计(752型),上海美谱达仪器有限公司;循环水多用真空泵(SHZ-3),郑州朋来仪器有限公司;Nicolet6700傅里叶变换红外光谱仪,美国PerkinElmer公司。1.2方法1.2.1乌江醇铁ii的制备乌鸡低聚肽→溶解(密闭)→加入抗氧化剂→调整pH值→加入FeCl2→恒温螯合→浓缩→醇沉→抽滤、洗涤→干燥得成品1.2.2铁离子含量的测定采用硫酸亚铁铵(Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O)配制10μg/mL铁离子标准溶液,吸取铁离子标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL,分别加入10%抗坏血酸溶液2.0mL,邻菲罗啉溶液3.0mL,蒸馏水定容至50mL。在37℃下反应60min,以不加铁离子的试剂空白溶液作参比,510nm处测定吸光度。以铁的浓度C(μg/mL)为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线。称取乌鸡多肽铁0.05g,HCl辅助溶解,配制成0.1%乌鸡多肽铁溶液。准确称取1mL样品溶液于50mL容量瓶中,按照标准曲线步骤测定其吸光度。铁离子含量(mg/kg)=Cm×V1/V0(mg/kg)=Cm×V1/V0式中:C为标准曲线上查得样品试液相应的铁含量,μg;m为样品的质量,g;V1为测定时所取样品试液的体积,mL;V0为样品处理后的定容体积,mL。铁螯合率的测定:螯合率/%=m1m0×100/%=m1m0×100式中:m1为螯合物中铁的量,mg;m0为加入反应体系中铁的总量,mg。多肽铁螯合物得率的测定:螯合物得率/%=W1W0×100/%=W1W0×100式中,W1为多肽铁螯合物的总量,mg;W0为乌鸡肽与铁盐的总质量,mg。1.2.3温度和时间对金属离子的螯合反应的影响影响乌鸡肽螯合铁的合成工艺的主要因素有乌鸡肽浓度、配位比、反应pH值、反应的温度和时间等。一般情况下,金属离子的螯合反应是室温下的快速反应,温度和时间对它的影响都不大。本实验采用在室温下,即25℃下反应30min。加入抗血酸的目的是作为抗氧化剂能够抑制Fe2+的氧化。本文主要讨论乌鸡肽浓度、肽盐比以及反应pH对螯合效果的影响。1.2.4红外光谱测定将固体乌鸡肽铁鳌合盐样品5mg,放入玛瑙研钵中,放入干燥的光谱纯KBr500mg,混合研磨均匀(在红外灯下进行),装入压片模具,压片得到透明的KBr样品片,利用傅里叶红外光谱仪进行定性分析,得到光谱图。按同样方法对乌鸡肽样品进行红外光谱测定。仪器设备与参数设置:SpectrumGX型傅里叶变换红外光谱仪(美国PerkinElmer公司),DTGS检测器,光谱范围为4000~400cm-1;分辨率4cm-1,扫描信号累加次数为32次,扫描时扣除了水和CO2的干扰。2结果与分析2.1生产乌江二甲苯ii硫合物的条件选择2.1.1反应物浓度对乌苏烷反应的影响乌鸡肽浓度是影响螯合反应的一个重要因素,从反应动力学的角度来看,较高的反应物浓度可使反应向生成物方向进行得更彻底,产率得以提高,但是当反应物浓度增加到一定量时产率不再提高,过高的反应物浓度会造成乌鸡肽的浪费。图1显示,乌鸡肽在浓度为4%的时候螯合率与螯合物得率最高,选取乌鸡肽浓度4%作为适宜浓度。2.1.2肽盐比对多肽得率的影响乌鸡肽与亚铁盐的质量比是影响螯合反应的另一个重要因素,质量比太小,不能形成稳定的环状结构,螯合物不稳定;质量比太大,会造成多肽的浪费。由图2可以看出,随着肽盐比的增加,螯合率,螯合物得率均呈增加趋势,并且4∶1时增幅趋于平缓。推测在肽盐比为4∶1时多肽已经足够螯合全部的Fe2+。选取肽盐比4∶1作为适宜参数。2.1.3ph值对多肽铁螯合物的影响反应pH值是影响多肽微量元素螯合反应的主要因素之一,在pH值较低的酸性条件下,H+将与金属离子竞相争夺供电子基团,从而不利于多肽铁螯合物的形成;在pH值较高的碱性条件下,OH-与供电子基团争夺金属离子,形成氢氧化物沉淀,也不利于螯合物的形成。从铁离子含量趋势可以看出随着pH值的上升铁离子含量慢慢逐渐降低,而得率则随着pH值的上升大幅增加,至溶液呈中性时上升趋势趋于平缓。综合这2个因素,选择pH=6适宜反应pH。2.1.4鸡肽文化对螯合物得率的影响选择乌鸡肽浓度、肽盐比和反应pH三个因素进行正交试验设计,如表1所示。如表2,通过对螯合率的极差分析结果可以看到,在影响螯合率的3个因素中,按主次顺序排列为B>A>C,即肽盐比对螯合率的影响最为重要,乌鸡肽浓度次之,反应pH最小。最优组合为A2B1C1,即在乌鸡肽浓度4%,肽盐比为5∶1,反应pH为4时螯合率最高。通过对螯合物得率的极差分析结果可以看到,在影响螯合物得率的3个因素中,按主次顺序排列为A>C>B,即乌鸡肽浓度对螯合物得率的影响最为重要,反应pH值次之,肽盐比最小。最优组合为为A2B1C2,即在乌鸡肽浓度4%,肽盐比为5∶1,反应pH为5时乌鸡肽铁螯合物得率最高。由于在螯合反应调pH值前溶液本身pH较接近4,从节省时间与工艺成本上考虑,选取乌鸡肽浓度4%,肽盐比为5∶1,反应pH为4为最适宜螯合条件。在此条件下螯合率为(84.76±0.12)%,螯合物得率(40.27±0.15)%。与方法相同的同类工艺相比,螯合率与螯合物得率相对较高,说明乌鸡肽在原料上对Fe3+的螯合更具选择性。2.2鸡肽铁螯合物的ir图谱由图4可知,乌鸡肽与其亚铁螯合物吸收峰相比,在强弱和位置上有明显的变化。乌鸡肽铁(Ⅱ)螯合物在3030cm-1IR的铵峰消失,而在1046cm-1处出现了吸收峰,说明Fe2+与氨基有较强结合。在乌鸡肽IR图谱中3385cm-1处有宽吸收峰(OH与NH伸缩振动频率重叠),同时处在924cm-1处有吸收峰,说明含有游离-COOH。乌鸡肽铁(Ⅱ)螯合物IR图谱中螯合后3385cm-1处的宽吸收峰变窄,且955~915cm-1没有吸收峰,说明乌鸡肽铁(Ⅱ)螯合物图谱中没有—COOH结构。1740cm-1附近未出现吸收峰,说明乌鸡肽铁螯合物中不存在游离的羧基,推测羧基也以共价键的方式与铁离子结合。此外,乌鸡肽铁(Ⅱ)螯合物IR光谱在2357cm-1处有强吸收峰是C≡N的特征吸收峰,其IR光谱在1046cm-1处产生了C—N键强吸收峰,小峰减少,说明N—H的数量和结构发生了变化。由于氮原子的共用电子对铁原子的贡献,导致了CN键偶极性的增加。3小鼠体内小鼠中cl24hpa质量比对乌苏烷反应的影响本研究通过单因素及正交试验确定了制备乌鸡肽铁(II)螯合物的最优工艺条