生姜有效成分在脾胃虚寒组大鼠组织分布及归经的研究

生姜有效成分在脾胃虚寒组大鼠组织分布及归经的研究

中医的经络理论是历代医家根据中医理论和中医疗效来总结的。它是中医理论体系的重要组成部分。中药归经理论的现代研究始于50年代,主要工作为整理古籍文献资料,对归经的含意、起源、发展、分类、临床应用及存在问题进行探讨。尽管在归经上仍处于探索阶段,但却是有意义的尝试。目前关于中药归经的研究方法一般从文献研究、临床研究和实验研究3个方面进行,其中研究最多的当属实验研究。文献研究是从五味、四气、脏腑、经络、解剖部位、药理作用等多方面考证与分析归纳文献。实验研究主要从药理效应及作用部位、有效成分体内分布及代谢过程、微量元素体内分布、受体、环核苷酸体内浓度变化、载体学说、蛋白质组学等方面进行。上述研究,从不同的角度验证了归经理论的客观性和科学性。尤其是中药有效成分脏腑组织分布与归经的研究。据报道,与传统归经的吻合率达到87%,表明中药归经与其有效成分的脏腑组织分布之间有密切的联系。施怀生等运用统计学的方法对32种中药归经情况及其药物体内代谢过程的关系进行分析,提出了药物动力学的总体情况及吸收、分布、排泄各环节,均与该药物的归经密切相关,药物在各脏腑所对应器官内的血药浓度,可直接反应药物归经的基本情况。因此,以中药功效物质为对象,采用药物动力学方法研究归经,具有可行性。中医药学是基于病理条件下形成和建立的。归经的认识,离不开药物的作用和特定的病理环境。因此,开展归经的现代研究,在充分利用现代科技手段的同时,应该与中医病证和中药药效结合起来,才能获得符合中医认识的结果。综合上述认识,笔者提出“中医病证-药效-药代动力学”结合研究中药归经的系统方法。即在中医病证模型上,观察药效,并采用药动学方法研究药物在脏腑组织的分布。通过药物在脏腑组织分布,认识中药的归经。生姜为姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的新鲜根茎。性辛,微温。归肺、脾、胃经。主要有解表散寒、温中止呕、化痰止咳、解鱼蟹毒的作用,主要用于风寒感冒、胃寒呕吐、寒痰咳嗽、鱼蟹中毒。生姜的化学成分复杂,现已发现100多种,包括挥发油、姜辣素、二苯基庚烷和黄酮类等,其中挥发油主要为单萜类物质;姜辣素中有姜酚类,姜烯酚类,姜酮类;二苯基庚烷主要为线性二苯基庚烷类和环状二苯基庚烷类化合物,姜辣素不仅是生姜特征性风味的主要呈味物质,也是生姜多种药理作用的主要功能因子,姜辣素中的姜酚是生姜的主要生物活性成分,生姜的多种药用价值也是因为姜酚在起作用,姜酚中又以6-姜酚浓度最高,其生物活性也最强,因此6-姜酚常作为评价生姜的客观指标。目前,对生姜化学成分分析、有效成分提取、药理作用研究等方面均取得了较大进展,但有关生姜归经的研究报道很少。本研究在中医药理论的指导下,基于中医病症模型,采用药代动力学方法,观察生姜的有效成分在大鼠的血液和体内组织分布情况,探讨生姜有效成分体内分布生姜归经的相关性。1材料和方法1.1姜酚、姜烯酚生姜,为姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鲜根茎,市售,经河南中医学院陈随清教授鉴定为正品。6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚:由河南省中医药研究院惠赠;生理盐水:河南双鹤华利药业有限公司,批号:12020605B;甲醇(色谱纯):迪马科技有限公司;其他试剂均为市售分析纯。1.2仪器、检测方法低速离心机:上海安亭科学仪器厂;AE240电子分析天平:瑞士梅特勒仪器有限公司;Waters2695高效液相色谱仪:美国Waters公司;Waters2996二极管阵列检测器:美国Waters公司;Empower色谱工作站:美国Waters公司;AE240电子分析天平:瑞士梅特勒仪器有限公司;TGL-16gR型高速冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂;XK96型快速混匀器:中国姜堰市新康医疗器械有限公司;AE240十万分之一分析天平:瑞士梅特勒仪器有限公司;KQ3200B超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司。1.3动物饲养及管理SPF级Wistar大鼠,体质量(300±10)g,雄性,分笼饲养在(20±2)℃的动物室,专人饲养和管理;实验鼠喂养饲料为标准全价饲料,购买于郑州大学医学院动物实验中心;合格证号:SCXK(豫)2010-0002。1.4实验方法1.4.1-1制备5倍量水取生姜,切碎,取碎末1.8kg放入不锈钢容器内,第一次加入5倍量水煎煮40min,滤过,滤液待用;残渣加入3倍量水煎煮30min,滤过,合并两次滤液经过低速离心机离心后浓缩至300mL备用,即得3g·mL-1生姜水煎液。1.4.2灌胃4摄食脾胃虚寒动物模型:大鼠饲养环境室温保持在20℃左右,不限食水饲养3d后开始每天上午按照10mL·kg-1的量给模型组大鼠灌胃4℃食醋,连续造模10d。1.5姜的温和实验1.5.1连续给药大鼠质量指标30只雄性大鼠,室温保持在20℃左右,不限食水饲养3d后随机分为3组,空白组、模型组及正常给药组各10只,各组大鼠禁食不禁水24h后,称质量,标记。每天上午造模,空白组灌胃生理盐水10mL·kg-1;模型组和正常给药组按1.4.2项下方法造模,第6天下午正常给药组大鼠按剂量开始灌胃给药,给药体积均为10mL·kg-1,连续给药5d。实验期间,观察动物外观行为变化,并每天记录大鼠体质量、进食量变化。1.5.2一般观察1.6姜的组织分布实验和药物动力学参数的分析1.6.1模型的造模及给药30只雄性大鼠,随机选4只作为空白组,用于取血及组织标本;剩下的大鼠随机分为两组,每组13只,一组为正常给药组,另一组按照1.4.2项下方法造模为模型组,所有大鼠禁食不禁水饲养24h后分别进行实验。模型组及正常给药组分别在灌胃给药(生姜水煎液)后5min、10min、15min、20min、25min、30min、45min、60min、90min、120min、150min摘除眼球取血,置10mL的离心管中,备用;断头处死,迅速取出心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠和脑,均按1.6.2项下的方法处理。1.6.2组织病理学检测血清样品4000r·min-1离心8min分离血清,精密吸取上清液1mL置于10mL具塞试管中,加入甲醇4mL,漩涡振荡5min,6000r·min-1离心20min,取3mL上清液;剩余再加入4mL甲醇,方法同上,合并2次的上清液,氮气吹干,残余物加入2mL甲醇定容,过0.45μL微孔滤膜过滤,进样。完整取出各组织,用生理盐水洗去表面浮血,吸干精密称取质量,放入离心管,于-20℃保存,测定前取出该组织样品,按2mL·g-1的比例加入生理盐水制成组织匀浆液,匀浆液加入2倍体积的分析甲醇,漩涡振荡10min,6000r·min-1离心20min,取上清液;残渣再加入2倍体积的甲醇,方法同上,合并2次的上清液,氮气吹干,残余物加入2mL甲醇定容,过0.45μL微孔滤膜进样。1.6.3流动相及紫外检测波长l色谱柱:DikmaplatisilODSC18(5μm,250.0mm×4.6mm);流动相:A为水,B为甲醇;洗脱梯度见表1;流速:1mL·min-1;柱温:30℃;紫外检测波长:227nm;进样量:20μL。见表1。1.6.4标品溶液的制备精密称取6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚各1.01mg、0.13mg、0.12mg标准品,于10mL容量瓶中,加适量甲醇使其充分溶解,加甲醇至刻度,然后再各抽取1mL混合加入适量甲醇至刻度。再分别依次稀释成6-姜酚浓度分别为0.505mg·L-1、1.01mg·L-1、2.02mg·L-1、5.05mg·L-1、10.1mg·L-1、20.2mg·L-1、50.5mg·L-1、101mg·L-1,8-姜酚浓度分别为0.06mg·L-1、0.12mg·L-1、0.24mg·L-1、0.60mg·L-1、1.20mg·L-1、2.40mg·L-1、6.00mg·L-1、12.00mg·L-1,6-姜烯酚浓度分别为0.065mg·L-1、0.130mg·L-1、0.260mg·L-1、0.650mg·L-1、1.300mg·L-1、2.600mg·L-1、6.500mg·L-1、13.000mg·L-1的系列标准品溶液,4℃冷藏避光贮藏备用。1.6.5保留时间的确定在上述色谱条件下,空白血清中和正常组织液中6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚峰形良好,不受内源性杂质峰干扰,保留时间分别为:18.3min、41.5min、43.5min。1.6.6提取和测定血清样品分别量取1.6.4系列浓度的标准品溶液100μL,置具塞离心管中,50℃水浴,氮气吹干,再分别加入正常组织100μL至上述离心管中,制备成系列相应浓度的含药血清样品溶液,按1.6.2项下生物样品处理方法提取处理后分别进样,进行色谱分析。用待测物浓度(C)为横坐标,待测物峰面积(A)为纵坐标进行线性回归,求得各组织、各标准样的标准曲线R值均大于0.99,各组织在不同范围内线性关系良好,符合分析测定要求。1.6.7提取回收率测定结果分别取相应低、中、高浓度的混合标准品溶液100μL,每个浓度平行做6份,置具塞离心管中,50℃水浴,氮气吹干,再分别加入血清和正常组织匀浆液100μL至上述离心管中,制备成相应浓度的混标样品组织液,按1.6.2项下的生物样品处理方法提取处理后分别进样,记录峰面积并按回归方程计算药物浓度。由测定结果可知,该方法测得各组织中3种标准品的提取回收率为58%~72%;方法回收率为93%~113%,符合生物样品分析的质量控制要求。1.6.8提取药物浓度分别取相应低浓度、中浓度、高浓度的混合标准品溶液100μL(各2份),置具塞离心管中,50℃水浴,氮气吹干,再分别加入血清和各正常组织匀浆液100μL至上述离心管中,制备成相应浓度的混标样品组织液,按1.6.2项下生物样品处理方法提取处理后,其中一组用来每天内连续测定3次,另一组每天进样1次连续测定3d,记录峰面积并按回归方程计算药物浓度。由测定结果可知,所有样品的日内RSD和日间RSD均小于10%,精密度良好,符合生物样品的质量控制要求。1.6.9提取药物浓度分别取相应低、中、高浓度的混合标准品溶液100μL(各2份),置具塞离心管中,50℃水浴,氮气吹干,再分别加入血清和各正常组织匀浆液100μL至上述离心管中,制备成相应浓度的混标样品组织液,按1.6.2项下的生物样品处理方法提取处理后,一组用来测定12h后样品,另一组用来测定24h后样品,记录峰面积并按回归方程计算药物浓度。由测定结果可知,所有样品的日内RSD和日间RSD均小于10%,精密度良好,符合生物样品的质量控制要求。1.7统计方法采用SPSS17.0统计软件进行数据分析,计数资料采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1造模成功的原因结果显示,模型组和生姜组与空白对照组比较,造模大鼠表现为倦卧少动,反应迟钝,唇色苍白,捉拿时反抗无力,渐见体型瘦弱,可见便溏;平均体质量和平均进食量日渐下降,有显著性差异(P<0.05),说明脾胃虚寒模型造模成功;生姜组在第6天给药后,体质量和进食量逐渐恢复到正常组相当水平(P<0.05),表明生姜温中散寒作用明显。2.26各组大鼠血清中6-姜酚、正常组的血药浓度6-姜酚给药5min就能在血中检测到,可维持120min。血药浓度高,维持的时间长;模型组大鼠血清中6-姜酚的浓度高于正常组。见表2。6-姜烯酚、8-姜酚在正常给药组血清中没有检测到,在模型组中均能检测到但维持时间短、浓度低。见表3。2.36-姜酚、6-姜烯酚和8-姜酚的组织分布和药物动力学参数2.3.1组织中6-姜酚的浓度结果表明,6-姜酚在大鼠组织中分布比较广泛。在正常组和模型组中除了脑组织,其他组织中均可检测到。6-姜酚的浓度从高到低依次是:胃、小肠、大肠、肝、肺、肾、脾、心,其中在模型组的胃、小肠中的浓度明显高于正常组。表明6-姜酚的组织中分布对于胃、肠有明显的趋向。见表4、表5。6-姜烯酚、8-姜酚在正常组大鼠组织中未能检测到,而在模型组的胃、大肠、小肠、脾中可以检测到,但除了胃里浓度较高外,肠和脾中浓度均比较低。见表6。2.3.2药动学参数药动学参数AUC0-t即血药浓度-时间曲线下面积,是评价药物吸收程度的重要指标,由于AUC的大小与药物吸收后进入体循环的量成正比,反映了进入体循环药物的相对量大小,故不同成分在不同组织中的AUC的数值大小反映了药物在不同组织中的含量的大小。6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚在大鼠的血清和组织中的药动学参数如下。数据所示,模型组血清中6-姜酚的AUC0-t大于正常组,不同组织中胃、肠有明显的吸收,6-姜酚的AUC0-t从大到小依次是:胃、小肠、大肠、肝、肺、肾、脾、心;6-姜烯酚在模型组组织中AUC0-t从大到小是:胃、脾、小肠、大肠;8-姜酚在模型组组织中AUC0-t从大到小是:胃、大肠、小肠、脾。见表7、表8、表9、表10、表11。3讨论3.1正常组和见表1生姜的主要有效成分姜酚,是姜及其产品的品质鉴定的依据。本实验以6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚为对象,用高效液相色谱法对生物样品中姜酚进行定性定量分析。实验结果显示,生姜的3种主要药效成分在大鼠的胃、肠组织中富集比较多。正常组与脾胃虚寒组比较显示,6-姜酚在中焦虚寒大鼠的胃有更为明显的富集,且保留时间更长,上述结果与生姜归胃经和温中功效相印证。大肠、小肠同属消化器官,干姜中3种成分在大肠、小肠中的高浓度,表明生姜归胃经不仅表现在胃本身有较高的药物分布浓度,而是表现为消化道都有较高的药物分布浓度。中医认为脾为后天之本,主运化水谷。西医认为小肠是重要的消化器官,饮食营养的消化、吸收主要在小肠完成。从功能上看,西医小肠与中医脾的功能更为接近,故6-姜酚在小肠、大肠的分布实际上与中医生姜归脾经的认识有密切关系。当然,我们在模型动物中也观察到,6-姜烯酚在脾脏有较高的分布浓度,其实际意义有待于进一步探讨。3.2生姜5种有效成分在肺中的分布6-姜酚在肺中有分布,正常组维持时间为20~90min;模型组维持时间为5~120min,但分布浓度明显低于胃、小肠和大肠。同时6-姜烯酚、8-姜酚在肺中未检出。从生姜3种有效成分分布上看,在肺中没