中国东亚钳蝎毒中多肽的分离与鉴定

中国东亚钳蝎毒中多肽的分离与鉴定

1抗癫痫肽的药物成分蝎子是中国传统的中药，其有效药物成分是蝎子。迄今为止,从蝎毒中可鉴定出的活性多肽和酶多达几十种,但在医药上真正具有确切疗效的多肽仅限于抗癫痫肽(anti-epilepsypeptide,AEP)、镇痛肽(scorpionanalgesicpeptide,SAP)和抗肿瘤肽(anti-neoplasticpeptide,ANP)等几种成分。蝎毒抗癫痫肽对癫痫具有很强的抑制作用且不易使人产生依赖性,是一种理想的抗癫痫药物;蝎毒镇痛肽不仅具有较强的镇痛作用,而且不会象吗啡和杜冷丁类药物那样容易使人产生成瘾性;而蝎毒抗肿瘤肽不仅能高选择性地杀伤人肝癌细胞株等多种肿瘤细胞,而且能够提高正常组织的免疫活性,增强机体抗放化疗的辐射能力。Zhou等首次用三步色谱法在蝎毒中分离得到了抗癫痫肽并测定了其N端50个氨基酸序列;王起振等采用离子交换色谱和凝胶排阻色谱从粗毒中分离出镇痛肽;韩雪飞等采用一步CMSephadexC-50超长柱从粗毒中纯化了镇痛肽;孔天翰等分别用低压阳离子交换柱和低压排阻柱及离子交换柱从东亚钳蝎中分离和提取了抗肿瘤肽。本实验通过高压阳离子交换和凝胶排阻色谱柱,提供了一种快速的能够同时对全蝎毒中的抗癫痫肽、镇痛肽和抗肿瘤肽进行分离和鉴定的方法,并且在高压色谱柱提供的分离信息的基础上,在软胶上通过低压色谱柱对这3种多肽进行了较大量的分离和鉴定。2实验部分2.1实验用化学试剂中国东亚钳蝎(ButhusmartensiiKarsch,BMK)蝎毒用电刺激法提取,冷藏于冰箱。高压阳离子柱和排阻柱分别为Shim-PackWCX-1羧甲基柱(ϕ4mm×5cm)和Shim-PackDIOL-300预装柱(ϕ7.9mm×25cm),低压色谱用Pharmacia公司的CMSepharoseCL-6B羧甲基介质装柱(ϕ1.3cm×134.5cm)。所用化学试剂均为分析纯。高效色谱用岛津公司的LC-10A型高压液相色谱仪,常压色谱用BIO-RAD公司的Bio-logicLP型低压色谱仪。2.2高效离子交换色谱高压离子交换色谱流动相A液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4),B液为含0.5mol/LNaCl的A液。洗脱梯度程序为:0~5min,100%A液;5~40min,B液从0线性变化到100%。流动相流速0.5mL/min。样品为蝎毒原液40μL与60μLA液混合,12,000r/min离心5min,取上清液上样。280nm紫外检测。高压凝胶排阻色谱流动相为含0.2mol/LNaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)。样品为蝎毒原液经高压离子交换柱分离后的含抗癫痫肽、镇痛肽和抗肿瘤肽的收集峰,进样50μL。280nm紫外检测。低压离子交换色谱流动相与高压离子交换色谱相同。先用A液洗脱约一个柱体积,再用A液与B液的线性梯度洗脱约6个柱体积。上样和洗脱流速分别为0.2mL/min和0.3mL/min。样品为1.8mL蝎毒原液溶于4.5mLA液中,离心后取上清液上样。280nm紫外检测。2.3对小鼠的毒活性和药物活性的测定抗癫痫肽活性用马桑内酯(coriarialactone)诱发的惊厥SD大鼠模型测定;镇痛肽活性用小鼠醋酸扭体法测定;蝎毒抗肿瘤多肽活性用MTT法测定。在各方法中,每个样品用同法测定3次,取其平均值。3结果与讨论3.1柱上洗脱强度检测首先用一般常用的0~30minB液从0线性变化到100%,30~40minB液维持100%的洗脱方式对全蝎毒进行了分离。采用这种洗脱方式所得到的分离图谱在溶剂峰处只能检测到一个峰,在大约30min后也仅能看到一个明显的色谱峰。为了能够使蝎毒得到更好的分离,在降低B液洗脱强度(B液中NaCl浓度从0.8mol/L降到0.5mol/L)的同时采用了图1的洗脱方式。在图1中,全蝎毒在柱上的分离峰可以大概从时间上划分为3组:0~5min最先流出的一组峰,20~30min流出的中间一组峰,31~39min流出的最后一组峰。由于后面洗脱方式盐的浓度变化比较缓慢,洗脱强度变化比较缓和,因此,使原来只能检测到的一个溶剂峰,在此处被分离成至少3个峰;使原来在30min后只能检测到的一个峰,在此处也被分离成至少5个峰。结合文献可知,蝎毒中的抗癫痫肽、镇痛肽和抗肿瘤肽活性成分可能分别位于上述3组峰中的某一峰中。3.2不同的单次注射峰及用药时间分别收集图1中0~5min之间的3个主要色谱蜂(第一组峰,编号1~3),20~30min之间的6个主要色谱蜂(第二组峰,编号从4~9),30~40min之间的5个主要色谱蜂(第三组峰,编号10~14),分别测定它们的抗癫痫活性、镇痛活性和抗肿瘤活性,测定结果分别见表1、表2和表3。表1表明,在第一组峰中,仅峰3能够显著延长用马桑内酯诱发的惊厥SD大鼠的癫痫发作时间。因此,峰3(保留时间约3.5min)中应当含有蝎毒抗癫痫肽。而其中峰1和峰2的癫痫发作时间比两个生理盐水对照组时间稍长,可能是实验误差造成的;在表2中,注射峰6(保留时间约24min)后的小鼠的扭体次数显著小于注射其它峰后小鼠的扭体次数,因此可以确定其中含有蝎毒镇痛肽。由于安痛定B浓度小于安痛定A,小鼠的平均扭体次数也更大一些;而在表3中的5个接收峰中,峰13(保留时间约36min)的吸光度值明显小于其它色谱峰,表明它具有抗肿瘤活性,应当含有蝎毒抗肿瘤肽。3.3小鼠抗癫痫活性测定粗蝎毒经Shim-packWCX-1柱分离后,分别取含抗癫痫肽、镇痛肽和抗肿瘤肽的收集液各50μL,在DIOL-300高压排阻柱上进一步分离。含抗癫痫肽收集液在其上约13和18min被分离成两个峰,活性测定表明,约18min处的峰具有抗癫痫活性,其在Shim-packVP-ODS反相色谱柱上的纯度约98%;含镇痛肽收集液在其上约19和23min也被分离成两个峰,小鼠醋酸扭体法活性测定和Shim-packVP-ODS纯度测定,约23min处的色谱峰具有镇痛活性,纯度约97%;含抗肿瘤肽收集液在其上约5、17、20和23min被分离成4个峰,MTT法活性测定和Shim-packVP-ODS纯度测定,约23min处的色谱峰具有抗肿瘤活性,纯度约95%。3.4抗癫痫肽的分离图谱在高压离子交换柱提供的全蝎毒分离信息的基础上,在低压色谱上用具有较大吸附容量的与高压柱具有相同交换基团的CMSepharoseCL-6B介质对较大量的蝎毒在相似条件下进行了分离和鉴定,全蝎毒在CMSepharoseCL-6B柱上的分离图谱见图2。由于CMSepharoseCL-6B是软胶且柱本身较长,不可能采用较大的流速,而流速太低,分离过程的扩散效应较大,因此,这里用了0.3mL/min的流速。为了在不太长的时间内使全蝎毒得到较好分离,采用了与高压色谱洗脱程序相比平台和线性梯度洗脱阶段洗脱柱体积都较少的洗脱程序。全蝎毒在高压柱和低压柱上的分离图谱之间存在着很多相似性。在图2中全蝎毒的分离峰也可分为3组:0~600min处的一组峰,1200~2700min处的中间一组峰,3000~4500min处的最后一组峰。在A液的等度洗脱阶段,抗癫痫肽在两个柱子上都能得到较好的分离且都位于第一组峰的最后一峰中;在梯