氯代乙酰胺的细胞毒性和遗传毒性研究

氯代乙酰胺的细胞毒性和遗传毒性研究

溶液中的氯是一种强氧化剂，能有效杀死饮用水中的细菌和病毒。同时，许多副产物（生物多样性）也被生产。最典型的是三氟甲烷（ths）、氯仿酸钠（haa）和含碳饮用水（c-dap）。由于这些dbp，一些国家对饮用水中碳含量的限制越来越严格，许多饮用水厂（ddtp）不得不采用新的消毒技术，例如氯胺消毒。然而，在许多研究中，消毒饮用水中的氯胺可以产生许多新兴的含氮消毒副产物（n-dap），其中氯仿代理二胺作为一种高毒性的新兴七胺，其毒性远远高于普通七胺和其他饮用水的七胺。它对饮料中的霍奇斯毒性影响深远。在美国2000—2002年的一项饮用水调查中,HAcAms被首次报道为DBPs,在这项调查中主要采用液液萃取富集与气相色谱电子捕获分析技术,检测到了5种HAcAms存在于氯化消毒后的饮用水中,包括一氯乙酰胺(MCAcAm)、二氯乙酰胺(DCAcAm)、三氯乙酰胺(TCAcAm)、一溴乙酰胺(MBAcAm)和二溴乙酰胺(DBAcAm).最近,通过固相萃取(SPE)富集、高效液相色谱(HPLC)分离和三重四级杆质谱仪(tqMS)检测建立了能够对饮用水中13种氯代、溴代和碘代HAcAms进行全面测定的分析方法,结果发现氯代乙酰胺(CAcAms)的浓度水平普遍高于溴代和碘代乙酰胺,因此有必要对CAcAms开展更深入的毒性研究.Plewa等采用细胞增殖实验(MTT法)和单细胞凝胶电泳实验(SCGE法)测定了多种DBPs对中国仓鼠卵巢细胞的慢性细胞毒性和急性遗传毒性,发现HAcAms的毒性远大于一些常规的C-DBPs,例如THMs.然而,除了MTT法和SCGE法,流式细胞术(FCM)可以对HAcAms诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞进行测试,深入分析HAcAms的细胞毒性和遗传毒性的大小.同时,大鼠肾脏细胞(NRK-52E)已被用作研究化合物胞外毒性的一种模式细胞,已有学者对NRK-52E的诱变性、细胞毒性和凋亡机理进行深入探讨,然而对NRK-52E在HAcAms作用下的毒性研究相对较少.文献中采用该方法研究对比了DCAcAm和二氯甲烷(DCM)的毒性及相应风险,发现DCAcAm的毒性风险高于DCM.本研究使用4种毒性测试法,分别为MTT法、SCGE法、细胞凋亡测试和细胞周期阻滞测试,分析了3种CAcAms,即MCAcAm,DCAcAm和TCAcAm对NRK-52E的细胞毒性.同时,采用SPE富集,HPLC分离和tqMS测定的分析方法检测5个饮用水厂中3种CAcAms的浓度水平.结合3种CAcAms在饮用水中的实际浓度水平和毒性水平,综合分析比较了所研究的饮用水中3种CAcAms的毒性风险,为DBPs优先控制等级制定和水厂工艺优化提供理论支撑.1材料和方法1.1实验用细胞剂DCAcAm和TCAcAm标准品(纯度>98%)为德国AlfaAesar公司产品;MCAcAm标准品(纯度>95%)购于加拿大OrchidCellmark公司.实验用水(除水样外)为MilliporeMilli-Qsystem制备的超纯水(电阻率≥18.0MΩ·cm).NRK-52E购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,此细胞株已经被广泛用于研究癌症、细胞毒性以及凋亡机理;AnnexinV-FITC凋亡及细胞周期试剂盒,购自中国南京KeyGEN公司;Flowjo分析软件,购自美国TreeStar公司;流式细胞仪购自美国,型号为GuavaeasyCyte8HT.1.2种cacams的细胞凋亡分析和诱导细胞周期阻滞分析研究采用MTT法和SCGE法分别测定3种CAcAms的细胞毒性和遗传毒性.同时,采用FCM对3种CAcAms进行诱导细胞凋亡分析和诱导细胞周期阻滞分析.具体操作方法详见文献[10-11].1.3分析采用SPE富集,HPLC分离和tqMS测定的分析方法检测饮用水中3种CAcAms的质量浓度水平.具体检测方法详见文献.2结果与讨论2.13不同cacms的毒性级别2.1.1cacams的质量浓度-效应曲线及其回归分析使用酶标仪在490nm波长下测得的光密度值O计算抑制率,并将计算结果取平均,得出不同质量浓度的CAcAms对NRK细胞的抑制率,计算公式如下:式中:O实验指实验组小孔所测得的光密度值;O调零指调零对照组小孔测得的光密度值;O溶剂指溶剂对照组小孔测得的光密度值.将抑制率取平均值后绘制质量浓度-效应曲线,结果如图1所示.用SPSS软件进行单因素方差分析(ANOVA)发现,3种CAcAms与溶剂对照相比均有统计学差异(显著度P均在0.05以下).由表1可知,MCAcAm的最低细胞毒性质量浓度为30mg·L-1,在3种CAcAms中最低;其次是TCAcAm,最低细胞毒性浓度为800mg·L-1;DCAcAm的最低细胞毒性质量浓度最高,为5000mg·L-1.对所绘制的3种CAcAms的质量浓度-效应曲线进行回归分析,回归系数R2从0.96(DCAcAm)到0.99(TCAcAm).ρ50值是浓度-效应曲线中的中点所对应的消毒副产物的质量浓度大小,ρ50值的大小可以衡量所研究DBPs的毒性大小.在这3种CAcAms中,ρ50值最大的是DCAcAm,为6.39×103mg·L-1,表明DCAcAm的毒性在这3种CAcAms中最小;ρ50值最小的是MCAcAm,为31.7mg·L-1,表明MCAcAm的毒性最大.以ρ50值为指标可以得出3种CAcAms的细胞毒性排序为:MCAcAm>TCAcAm>DCAcAm.2.1.2cacams遗传毒性各因子的计数结果经过SCGE法处理后,运用CASP软件读取每个CAcAms的每个质量浓度组的100张图片,计算出尾矩的值,并且用横坐标表示CAcAms的质量浓度,纵坐标表示尾矩,绘制细胞暴露于3种CAcAms4h之后尾矩对质量浓度的箱线图,如图2所示.在图2中,测量值中间的50%的数据显示在方形盒子中,盒子的上限表示数据中由小到大排列在75%的尾距值,下限表示排列在25%的尾距值,而盒子中间的横线表示所测数据的中位数,盒子上方的横线为90%的尾距值,盒子下方的横线为10%的尾距值,盒子中间的实心方框表示所有数据的平均数.由于彗星的尾矩有一个较广泛的分布,选取平均数代表这一质量浓度所致的彗星尾矩的大小.对平均数进行单因素方差分析(ANOVA),计算得4种DBPs所导致的P值均≤0.05.由此可以得出各CAcAms最小的遗传毒性质量浓度,并且用遗传毒性的ρ50来衡量各CAcAms遗传毒性的大小,ρ50值为采用平均尾矩所绘制的剂量-效应曲线的中点所对应的CAcAms的质量浓度值.根据ρ50值的大小可以得出3种CAcAms的急性遗传毒性的排序,为MCAcAm>DCAcAm>TCAcAm.所得的ANOVA的结果见表2.2.1.3cacams诱导细胞凋亡染毒后的细胞经流式细胞仪及Flowjo软件分析后,将凋亡细胞的比例随CAcAms质量浓度的变化绘制成柱状图,结果如图3所示.由图3可知,经3种CAcAms处理的NRK细胞的凋亡细胞比例均随着3种CAcAms质量浓度的增加而增加.MCAcAm的凋亡细胞比例从8.15%增加到83.8%,DCAcAm的凋亡细胞比例从8.15%增加到19.9%,TCAcAm的凋亡细胞比例从8.15%增加到46.7%.根据以上结果可以得出,3种CAcAms在所测质量浓度范围内均显示出细胞的死亡是通过细胞凋亡的途径诱导的,其中MCAcAm的毒性最大,其次为TCAcAm,而DCAcAm的毒性要小于MCAcAm和TCAcAm.3种CAcAms诱导细胞凋亡能力由大到小排序为MCAcAm>TCAcAm>DCAcAm.FCM依靠荧光特性进行检测,通过PI/AnnexinV染色可以区分凋亡细胞和死亡细胞.细胞死亡是由于外来损伤导致,凋亡是一种程序性死亡,以DNA的降解为特点.太多的凋亡可以导致免疫缺陷和机能退化,太少的凋亡又能引起恶性肿瘤和淋巴组织增生.所以明确CAcAms导致NRK细胞毒性的途径对于了解CAcAms的毒性机理非常重要.由结果可知3种CAcAms相比于溶剂对照能够引起显著的细胞凋亡(P<0.05),其中MCAcAm引起的细胞凋亡最明显,其次为TCAcAm.这与MTT法所得的毒性大小结果一致,同时也表明3种CAcAms造成NRK细胞毒性的重要因素为细胞凋亡,即DNA的降解.2.1.4dcacam作用的细胞,4g期细胞比例的变化细胞的DNA含量和细胞凋亡的诱导都是通过细胞周期的调控进行的,由此,本研究检测了3种CAcAms对NRK细胞的细胞周期调控.经Flowjo软件分析的结果选取了高浓度数据组列于图4.图4中,G1,S和G2分别表示细胞周期的不同阶段;SubG1表示凋亡细胞.NRK细胞经3种CAcAms暴露4h后,G1期的细胞比例均有所增加.MCAcAm作用的细胞,G1期的细胞比例从46.61%增加到69.85%(图中未显示);DCAcAm作用的细胞,G1期细胞比例从46.61%增加到70.01%(图中未显示);TCAcAm作用的细胞,G1期细胞比例从46.61%增加到71.34%.同时,由图示可知G1期细胞比例的增加,伴随着S期和G2期细胞比例的降低.这3种CAcAms诱导G1期阻滞的能力由大到小排序为MCAcAm>DCAcAm>TCAcAm.考察MCAcAm和DCAcAm高质量浓度作用下的NRK细胞周期分布情况,发现当MCAcAm和DCAcAm的质量浓度超过100mg·L-1和500mg·L-1时,G1期的细胞数量开始下降,MCAcAm作用的G1期细胞从69.85%(100mg·L-1)降低到57.33%(500mg·L-1),同时开始出现亚G1期细胞,比例为16.2%.DCAcAm作用的细胞,在DCAcAm质量浓度超过500mg·L-1时G1期的细胞数量开始减少,从70.1%(500mg·L-1)降低至53.00%(5000mg·L-1),同时产生亚G1期细胞,比例为11.14%(5000mg·L-1).而TCAcAm没有亚G1期细胞出现.亚G1期的细胞代表凋亡细胞,表明只有当MCAcAm和DCAcAm在高质量浓度时,NRK细胞才会出现凋亡细胞.2.2cacams的质量浓度所调查的5个饮用水厂的出水中均检测到这3种CAcAms,如表3所示.其质量浓度大小排序均为DCAcAm>TCAcAm>MCAcAm.用氯胺做消毒剂的水厂中产生的CAcAms的质量浓度总体上远大于用氯做消毒剂的水厂.只有用氯胺做消毒剂的水厂4产生的TCAcAm的质量浓度略微低于用氯做消毒剂的水厂3产生的TCAcAm.需要说明的是,5个水厂原水中的氨氮经过常规和深度处理工艺处理后含量较低,因此未考虑投加消毒剂氯时氨氮会部分转化成氯胺.2.3饮用水对3种cacams的细胞毒性由于饮用水厂出水中消毒副产物的总毒性与两个因素有关,其一为饮用水厂中消毒副产物的质量浓度水平,其二为所测饮用水消毒副产物的毒性大小.选取3种CAcAms在水厂中的质量浓度水平(表3)与毒性指数Tc的乘积来表示这种饮用水消毒副产物在饮用水厂中的毒性风险,如式(2)所示.计算结果如表4和表5所示.由表4的结果可知,3种CAcAms在5个饮用水厂中的毒性都相对较高,其中,在5个水厂中,尽管MCAcAm的质量浓度水平低于DCAcAm和TCAcAm,但由于MCAcAm的Tc值高于DCAcAm和TCAcAm,故MCAcAm的细胞毒性大于DCAcAm和TCAcAm.而DCAcAm和TCAcAm在饮用水厂中的细胞毒性大小没有明显规律:在水厂1、水厂2和水厂3中,DCAcAm的细胞毒性低于TCAcAm的细胞毒性,在水厂3和水厂4中则相反.由表5的结果可知,MCAcAm的遗传毒性指数Tg值很高,其在5个水厂中的总遗传毒性明显高于DCAcAm和TCAcAm.观察DCAcAm和TCAcAm在5个水厂中总遗传毒性的大小可以发现,DCAcAm的遗传毒性在5个水厂中都高于TCAcAm,这与饮用水厂中总细胞毒性的计算结果略有不同.由上述结果可知,DCAcAm和TCAcAm的质量浓度虽然高于MCAcAm,但由于MCAcAm的毒性较大,造成的毒性风险要明显高于DCAcAm和TCAcAm.3饮用水中cacams的污染状况(1)4种胞外毒性测试方法,MTT法、SC