聚酰胺树脂在分离纯化黄酮类化合物中的应用

聚酰胺树脂在分离纯化黄酮类化合物中的应用

聚吡咯（pa，俗称尼龙国）是美国杜普特公司首次开发的纤维树脂，于1939年完成工业化。它是由一系列的酰胺基团聚合而成的一类高分子化合物,按其性质可分为两大类:非反应性或中性聚酰胺及反应性聚酰胺。层析分离中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合而成的尼龙6和由己二酸和己二胺聚合而成的尼龙66。聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有机溶剂,对碱较稳定,对酸尤其是无机酸稳定性较差,可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。聚酰胺是一类结构中含有重复单位酰胺键(-CO-NH-)的高分子聚合物,酰胺基团上的O、N原子在酸性介质中结合质子而带正电荷,以静电引力形成吸附溶液中的阴离子,故可与酚类、酸类、醌类、黄酮类等富含酚羟基的化合物形成氢键而被吸附,而与不能形成氢键的化合物分离。国内外对聚酰胺的研究已经非常深入,而且其应用范围及其广泛,仅在层析分离的应用就包括黄酮类、多酚类、醌类、酸类、钯、汞等金属的分离提取;甚至改性的聚酰胺可以分离蛋白质,寡聚酰胺可以作为探针用作DNA的电化学传感器。本文重点介绍聚酰胺在分离纯化黄酮类物质的应用及研究现状。1聚吡咯树脂层析成像研究1.1聚酰胺水剂的氢键缔合机理聚酰胺树脂对黄酮类化合物的吸附机理为“氢键吸附”学说。由于聚酰胺中含有丰富的聚酰胺基团,酰胺基团上的O、N原子具有很强的电负性,在酸性条件下就极易与质子结合形成带正电荷的基团;对于黄酮类和多酚类化合物,因为其富含酚羟基,在溶液中可以形成带负电的阴离子,所以带负电的酚羟基可以与带正电荷的酰胺基团通过静电吸引力形成氢键缔合产生吸附。这种氢键吸附强度主要取决于化合物中羟基的数目与位置、以及溶剂与化合物或溶剂与聚酰胺之间形成氢键的缔合能力大小,有一定的规律性:(1)形成氢键的基团数目越多,则吸附能力越强,分子中芳香化程度越高,则吸附性越强;(2)溶剂与化合物易形成分子内氢键者在聚酰胺上的吸附相应减弱;(3)聚酰胺与物质的氢键缔合能力在水中最强,在含水醇中则随着醇浓度的增高而相应减弱,在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合;(4)强酸或强碱均可破坏聚酰胺与溶质之间的氢键缔合。聚酰胺的这些性质就决定了它在黄酮类化合物分离纯化中起到的作用。1.2分离机理1.2.1“氢限制”理论1.2.2“双层析”理论1.3酰胺类化合物由于聚酰胺分子中含有大量酰胺基团和很长的脂肪链,而酰胺基团是极性基团,脂肪链是非极性的,这就决定了聚酰胺是一个极性相对较弱的高分子化合物。当用极性较强的溶剂作为洗脱液(如水、乙醇等)时,此时聚酰胺就作为非极性固定相,其层析行为类似反相分配层析(流动相为极性溶剂,固定相为非极性的层析),则首先被洗脱下来的是极性较大的化合物,随着洗脱剂溶剂极性的逐渐降低,化合物按照极性从大到小的顺序可相继被洗脱下来。2聚酰胺的分离和富集总黄酮的工艺研究在自然界中,黄酮类化合物广泛存在于多种植物和其他中药材原料中,例如回心草、甜茶、金莲花、益母草、银杏叶、山楂、甘蔗、板栗花、蜂蜜等里面都含有黄酮类化合物,而且在一些植物中其含量非常高,如在甜茶中黄酮含量高达9.0%~14.60%。黄酮类化合物的研究已经非常广泛而深入,其药理作用和活性研究也相当深入。有文献表明,黄酮类化合物有抗炎镇痛、抗过敏、扩张血管、抗氧化、抗心律失常、改善微循环、抗脂肪肝、防止动脉硬化、抗病毒、降血脂、减少糖尿病并发症、协同增进抗肿瘤药物疗效等药理作用。黄酮类化合物的精制纯化一般采用树脂法,不仅方法简单、成本低、效率高、稳定性好和容易再生等特点,而且其安全性也高,没有重金属和有毒有机试剂残留等问题。聚酰胺在层析应用中会遇到一些问题,如滤水性差、单位质量吸附量小、有小分子夹带的问题。王怡红等人聚酰胺柱进行了改进,即将聚酰胺涂装在硅藻土上,制成的改性聚酰胺柱,从而改善了滤水性,相应提高了单位质量聚酰胺的吸附量,消除了小分子夹带问题。同时可以预先筛去聚酰胺细粉或与硅藻土(1:2)混合物装柱,以及加压冲洗等方法克服冲洗速率慢的问题。当用含有甲醇的溶剂进行洗脱时,往往所得到的黄酮类化合物中含有低分子量的聚酰胺,可采用50%甲醇水溶液预先洗涤除去。山西医科大学药学院的白云娥、漆小梅等人,确定了用聚酰胺从金莲花中分离富集总黄酮的最佳工艺。首先比较30~60目、60~80目、100~200目这3种型号聚酰胺的静态吸附量和解吸率,确定了60~80目的聚酰胺对金莲花总黄酮的吸附量最大,解吸率最高;然后分别考察了上样药液pH值、上样浓度、最大吸附容量、洗脱溶剂的选择等因素对分离富集总黄酮的影响,确定了最佳工艺条件为上样药液pH值为3,上样浓度为1︰3(g·mL-1),最大吸附容量为0.2833g·mL-1(每1mL聚酰胺最大吸附0.2833g生药),洗脱溶剂为水和50%的乙醇。哈尔滨医科大学药学院的甘春丽,王晶等采用薄层聚酰胺和聚酰胺柱色谱作为分离手段,结合紫外、红外吸收光谱进行检测,从而达到从藤茶中分离得到黄酮醇与二氢黄酮醇类化合物的目的。藤茶水煮液低温过夜的结晶过聚酰胺柱,用乙醇梯度洗脱,20%~30%乙醇洗脱部分用聚酰胺薄层板色谱(展开剂:氯仿-甲醇-甲酸=50︰48︰2)结合紫外、红外吸收光谱图检测为二氢杨梅素;而40%~50%检测为杨梅素。杨梅素与二氢杨梅素的酚羟基数目相同,区别仅在2,3位饱和度不同,它们在聚酰胺上的色谱行为差别较小。如果采用聚酰胺柱色谱用填料进行分离时,很难得到纯品;而选用聚酰胺薄层填料进行柱色谱,由于其粒度较小,因此柱效较高,可得到纯品。但由于填料粒度较小,流速会减慢,故需要加压来加快流速。张蕾,廖琼峰等人采用聚酰胺-大孔树脂联用的方法富集苦参中的总黄酮。苦参样品溶液用聚酰胺吸附,先用水洗脱除去杂质,将除杂后的聚酰胺加于AB-8大孔吸附树脂顶部,用80%的乙醇溶液洗脱,这种方法能够有效地富集总黄酮,且可与其生物碱类成分有效分离。考察得到的最佳工艺条件为浸膏与聚酰胺比为1∶1,与树脂比为1∶3,用80%乙醇洗脱,收集洗脱液3BV,最终富集总黄酮的质量分数可达(53.6±2.2)%,收率为(72.1±3.7)%。这种聚酰胺-大孔树脂联用的方法比目前常用的黄酮富集方法效果要好,而且工艺比较简单,具有良好的应用前景。阎欲晓,黄玥用超声波辅助提取甘蔗叶中总黄酮,并对超声提取的工艺进行考察,得出乙醇浓度80%,提取温度60℃,超声提取时间60min,料液比1∶40,超声波功率为104W时为最佳提取工艺。然后采用聚酰胺树脂对甘蔗叶黄酮粗提物进行分离纯化。并研究甘蔗叶黄酮对羟自由基(·OH)、超氧自由基(O2-·)和亚硝酸(NO2-)的清除能力。甘蔗叶黄酮清除羟自由基的IC50为0.038mg·mL-1,清除超氧阴离子的IC50为0.092mg·mL-1,清除亚硝酸根的IC50为0.12mg·mL-1。朱茂田,马力利用超临界CO2流体从干姜中萃取出姜精油,然后用正己烷对其萃取,分液后上柱层析。吸附树脂采用聚酰胺树脂为填充物的柱层析法,不但吸附量大而且纯化效果好。最后得到生姜黄酮纯度为72.3%。李厚全,陈磊等探讨了聚酰胺对白背三七的纯化条件及效果。采用紫外分光光度法测定总黄酮含量,以总黄酮的保留率和转移率为指标,考察上样液和清洗液pH为3.0、上柱吸附流速为2BV/h、树脂药材比为2︰1、树脂径高比为1︰8、70%乙醇为洗脱液、清洗流速为5BV/h、洗脱流速为4BV/h为最佳纯化条件。在这些所筛选的纯化条件下,总黄酮的含量由粗体物的2.43%提高到了24.6%。此纯化条件使白背三七总黄酮含量提高了10倍以上,为了进一步研究作为参考依据。3聚合物载体的筛选聚酰胺在其他领域也有广泛的应用。例如用冰醋酸制备改性的聚酰胺,改性聚酰胺可对蛋白质进行吸附分离。树枝状聚合物聚酰胺-胺(PAMAM)是一种三维的、高度枝化的树枝状高分子,具有单一分散性、无免疫原性、细胞毒性较低、生物可降解等特性目前作为药物载体在药学领域引起了高度关注。聚酰胺-胺树形分子在处理造纸污水上面也有重要的应用。4聚酰胺层析分离机理聚酰胺树脂的应用范围十分广泛,其使用寿命长,再生利用效果好分离,操作简单,成本低,分离效果好等诸多的优点就决定的聚酰胺会得到更多的重视和青睐,且其在层析分离上的应用也会更加受到关注。聚酰胺的层析作用机理目前还没有一个比较系统科学的研究,相信随着聚酰胺受到的关注增多,会有越来越多的人从事这个机理研究工作,这也将会有一个更大的突破。聚酰胺分离机理的第一种学说是“氢键吸附”学说。当溶剂分子与聚酰胺或黄酮类化合物形成氢键缔合的能力越强,则聚酰胺对这两种化合物的吸附作用将越弱。聚酰胺层析柱就是利用这种性质对黄酮类化合物进行吸附、洗脱而分离的。Stahl等人结合前人的工作,采用两种不同极性溶剂系统来比较某些黄酮苷与黄酮苷元在聚酰胺柱上的层析行为。结果是:当采用极性较小的溶剂系统(苯∶丁酮∶甲醇=60∶20︰20)洗脱时,发现黄酮苷元比黄酮苷先被洗脱下来;而当采用极性较大的溶剂系统(水∶乙醇∶丁酮∶乙酰丙酮=65∶15︰15︰5)洗脱时,物质被洗脱出来顺序刚好与上面的相反。这种现象用“氢键吸附”学说无法解释。所以这时候有人提出了聚酰胺层析分离的第