中国胚胎早期发育过程的形态学观察

中国胚胎早期发育过程的形态学观察

中国猪，也被称为三头猪，属于节肢动物门。它有四个腿的亚门、四个腿的四肢、四个剑突、一个胃、四个岛屿和东部的龙舌兰。这是西太平洋沿岸温暖的水生栖息地。主要分布在日本岛户内海和九州岛，中国东南沿海，台湾湾岛西岸，越南，菲律宾，苏门答腊岛以东，印度北坡罗洲、加里斯曼丹岛东岸和北岸。鲎最早出现在距今近4亿年的古生代奥陶纪,这种古老的海洋底栖动物具有重要的经济价值和科研意义:它是一种美味的海产食品;其肉、壳、胆、尾、卵、血均可入药,可治疗白内障、青光眼、胃炎、皮肤过敏、跌打损伤、肺结核咯血、高热等;鲎是研究受精和胚胎发育的理想材料;其血淋巴及其内含物具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等生物活性,是生产鲎试剂的原料;其视觉器官是电子仿生学研究很好的材料,如复眼是雷达研究的原型,与国防工业关系密切;其甲壳可提取甲壳素和壳聚糖,用于生产人造皮肤;等等.近百年来,随着其各种价值的开发利用,特别是鲎试剂的研制成功并广泛应用于医药卫生、食品检验等方面,对鲎的需求量越来越大.但连年的大量捕杀、海岸开发和生态环境的恶化,鲎栖息地受到人类的严重破坏,其生活习性受到人类的严重干扰,使鲎的数量急剧减少,其生存面临巨大的威胁.所以积极开展鲎的人工授精育苗和人工养殖技术的研究,对鲎生态习性的了解,对鲎种群个体数量的补充,对鲎资源的保护有重要的意义.胚胎发育研究进入20世纪以来,经历了描述胚胎学和试验胚胎学两个阶段,发表的论文各自从不同侧面对鲎胚胎早期发育作了描述,但至今仍不见详细而又完整的中国鲎早期发育的报道.本文应用人工授精技术,开展中国鲎早期发育研究,详细描述中国鲎胚胎孵化各期及一、二龄幼鲎的形态变化.1材料和方法1.1材料表面厦门黄厝水产市场收购的成鲎.1.2/细胞观测法解剖刀、剪刀、镊子、勺子烧杯(2000mL×2500mL×2)、漏斗、滴管、载玻片、盖玻片、注射器、玻璃缸、塑料托盘、纱布显微摄影相机、普通光学显微镜(400×)、体视镜(10×)、Bouin固定液(苦味酸饱和溶液[75mL]、40%福尔马林[25mL]、冰醋酸[5mL])、2.5%的戊二醛固定液、新鲜沙滤海水.1.3工艺教学的步骤(1)雄生殖孔侧缘观察.在雌鲎生殖盖板后侧和生殖孔相通的输卵管处,用手挤压.见有成熟的卵排出,该雌鲎留用.在雄鲎生殖孔侧缘用注射器抽取血淋巴液(内含精液),迅速与等量的海水混合均匀,滴于载玻片上,盖上玻片,置400×显微镜下观察,确认有游动的精子,雄鲎留用.如果反复做标本3～5次还是无法在视野中发现游动的精子,即弃之,换别只雄鲎再检查.(2)海水淡化后的卵石化雌鲎的头胸部及附肢基部两侧作数处切口让体液快速流出.用海水洗去体液后,切开头胸部腹面周缘壳皮,将卵取出置于盛海水的大烧杯内.用玻棒轻轻搅拌,脏海水弃之.反复加海水冲洗,直至海水变清.尽量清除混杂其中的内部器官碎片及不良卵,后将卵于平铺于盛有1/3海水的干净塑料托盘上.雌鲎的体液有抑制受精的作用,应注意洗净体液.同时应注意中国鲎的卵子很容易被洗坏,清洗时动作应轻柔,清洗次数不宜超过4次.(3)雄头腹部附头腹部制备.采精与采卵同时或稍后进行.用解剖刀切开雄鲎头胸部附肢基部侧缘.流出的体液即混有精液,用盛有海水的大烧杯盛之,轻微搅拌,使混合均匀,后用纱布迅速过滤除去血凝块,(4)人力资源把用纱布过滤过的雄鲎体液倒入铺有卵的塑料托盘上,用玻棒轻轻搅拌使海水与体液混合.静置1h更换新鲜海水,受精即完成.1.4海水淡化试验从受精的第2天起,每天早晚各换经砂粗滤的新鲜海水1次,受精后第10天起,1天更换1次海水,直至幼鲎孵出.试验期间将受精卵放在28°C的恒温箱中孵育,换水时挑去变绿的坏死的卵.1.5浮游生物的饲养孵出的—龄幼鲎在室温中用大的玻璃器皿饲养,砂粗滤的海水中未放任何饲料,每周换新鲜海水1次.饲养二龄幼鲎的海水中投放如轮虫一类浮游生物.2结果与分析2.1生殖细胞2.1.1卵体的生长特性中国鲎卵属中黄卵,内含大量的乳白色卵黄,外被厚而坚韧,富有弹性而半透明的卵胶膜.刚产出的卵由于在母体内相互挤压而呈一面或多面扁平的不规则形状,入水2～3h后由于扁平的地方膨胀而变成球形或椭球形,直径2.7～3.2mm.成熟卵为米黄色或灰白色,入水逐渐转黄到褐黄.中国鲎卵的比重较海水大,故为沉性卵,具粘性.2.1.2精髓图1:2中国鲎的精子属鞭毛型精子,蝌蚪状.2.2胚胎发育过程的观察2.2.1卵黄块的形态精卵融合后,合子高速分裂,而不伴随体积和物质的增加,细胞的数目越来越多.中国鲎卵为中黄卵,其卵裂属全裂到表裂的—种过渡形式,卵裂形成表面囊胚.受精后1～2d内,可见70%～80%的卵进入了卵裂期,但由于发育速度不一致,在受精后第2天下午观察可见多种卵裂相:部分受精卵的一极表面有2至3条相互交错的不规则的浅沟;部分卵从卵黄中分出一个独立的很小的卵黄球,而其余部分卵黄没有变化;部分卵卵黄块被—条卵裂沟完全分割为比例约为4.5∶5.5的两部分;部分卵在一极已经有多次卵裂,将该极的卵黄分割成梅花状.随后的几天里,卵裂在快速地进行,同时卵黄块也活跃地进行流动.相互交错而又不规则的卵裂沟逐渐由一极向另一极扩散,卵黄块被分割成许许多多的大小不等的小块,好似卵裂球越来越小,卵黄块表面越来越光滑.第4天由于卵黄块在一极发生皱缩(或称凹陷),而在卵黄块和卵胶膜间出现一个小空腔,内充满透明的液体,有资料说这时内卵膜已经形成,内卵膜与卵胶膜分离.第6天,卵裂沟更浅更模糊,卵裂球之间的界限也模糊不清,卵表面光滑,表面囊胚形成了(图版I:4).2.2.2卵日果干预缺失造成卵死率高囊胚形成后进入了胚带形成和原肠作用阶段,这阶段胚胎发育一方面是外部器官的发生,另一方面是胚胎内部胚层的形成和分化.但仅从卵的表面并观察不到较大的变化.在第16天见到个别卵出现梅花状突起,中间有一个小凹陷(图版1:5).这段时期逐渐有大量的卵变绿坏死,从最初的每天十几粒至四百多粒,直到受精后30d才又有所减少.目前尚不知是何原因促使其坏死,许多学者认为是未受精卵才坏死,但从未受精卵的对照组的坏死率,可以看出,坏死的卵不一定是因未受精而引起的死亡.到第一只幼鲎孵化出来的那一天,受精卵组的卵坏死率高达了70%,这可能与卵较密集有关.也有可能是在授精操作中卵洗过多次引起的.2.2.3胚体的解剖观察及蜕皮的发生过程在组织分化期中,胚胎完成3次胚内蜕皮,并在第2次胚内蜕皮的同时,胚体外胶膜也破裂蜕去,完成3次胚内蜕皮的胚体已具三叶幼体的雏型.第1次蜕皮发生在受精后第20天,蜕皮只发生在胚区,蜕下的皮小且常附在内卵膜上,难以发现.蜕皮后胚体与卵胶膜分离,卵径逐渐增大,由3mm增至4.5mm.卵胶膜变为乳白色,像磨砂玻璃般不透明,难于观察其内部结构变化,随着膨胀透明度有所改善.解剖观察,可见其有突起的一个小锥为尾锥部,将来发育成尾扇(腹部)及尾.随后的一个星期,其附肢原基不断地生长,由原来的小钮扣状渐变为长椭圆状再变为小附肢,前端开始分杈.椭圆形的侧器迁移到胚胎侧面.期间胚体球形,厚厚的背部有透明膜包被(图版Ⅰ:6,7).第2次蜕皮发生在受精后的第27天,并伴随着卵胶膜的破裂,但卵胶膜并不蜕去,而是附在内卵膜上.破裂的卵胶膜为棕色,内卵膜为乳白色,半透明,并继续膨胀,直径由4.9mm增至5.5mm.透过内卵膜能清楚地观察到如紧握的拳头状的胚体及胚体上的各附肢、尾锥以及胚胎背面的体节,但无几丁质外壳,附肢有极缓慢的一伸一缩运动.眼点出现,复眼开始分化,呈现出黑点状.此次蜕皮也不完整,只有背部区域蜕皮,蜕下的皮留在胚体腹部边缘(图版Ⅰ:8,9,10,11,12).第3次蜕皮发生在受精后第34天,此次为完全蜕皮.蜕皮后的胚体已具三叶幼体的雏形,身体扁平,眼点、侧器、附肢、书鳃等组织器官都已基本成型.蜕皮后的胚体腹部明显增宽增长,板状附肢明显.第3次蜕皮后内卵膜进一步吸水膨胀,直径增至6.5mm.胚体运动活泼,在内卵膜内积极翻滚,维持腹面朝上,背面朝下的姿势.胚体的几丁质外壳在侧脊靠眼点和侧器部分颜色渐变为褐色(图版Ⅱ:13,14,15,16).2.2.4幼的发育.蜕皮发生在受精后第46天,这次蜕下的皮从前端边缘到后端边缘并延伸到腹部和附肢,是一次完全的蜕皮.蜕皮后的胚体与刚孵化的幼鲎相似,如果此时人为地将内卵膜剥开强迫孵化,孵出的幼鲎与正常孵化的幼鲎没有区别,能够正常生长.胚体的几丁质甲壳透明,可透过甲壳看到树枝状的黄色结缔组织.腹部发育得与头胸部一样大,体被纤毛,书鳃一掀一翻,似有呼吸.胚体不活跃.侧脊眼点处的褐色加深,腹部背面体节愈合处也出现褐色,由中间向体侧渐淡(图版Ⅱ:17,18,19,20).2.2.5幼的孵化即将孵出的胚体仰躺,附肢活跃地划动着,前端的螯一张一合.利用螯将内卵膜刺破并撕扯开,幼鲎孵出(图版Ⅱ:21).孵出的幼鲎相当活泼,在水中用板状附肢划水仰游,由于头胸部较重,又少了剑尾的平衡,使幼鲎的游动线路呈螺旋状.实验观察光线可以刺激幼鲎的孵出.在黑暗中,完成第4次蜕皮的胚体几乎要再过3～5d才孵出,而让完成第4次蜕皮的胚体从黑暗处移至光亮处,一段时间后再移至黑暗处,如此反复,刚完成第4次蜕皮的胚体也可能在再次暴露在光线下一小段时间内用附肢的螯破坏内卵膜而孵出.2.2.6头胸部及腰椎部.刚孵出的幼鲎,身体扁平,长约7.5mm,宽约7.0mm,体白色,透明,几丁质外甲壳很软,附有细细长长的纤毛.体分为头胸部和腹部,剑尾未伸出体外.头胸部呈瓢状,背面有正中脊,左右两侧有两条纵向侧脊,正中脊的前端有一只单眼,两侧脊外方各有一只复眼和侧器,正中脊与两侧脊之间各有一条纵沟.头胸部有六对附肢,都呈雌性特征,即第一第二对附肢为钳状,头胸甲前端钝圆,口在头胸部中央,位于附肢基部内侧,后有一对小的唇瓣.腹部由8个体节愈合而成,侧缘呈锯齿状.腹面6对板状附肢在不断地一张一合.头胸部及腹部甲壳褐色部分颜色加深,区域扩大(图版Ⅱ:21,22).2.2.7蜕壳长的发育中国鲎的胚后发育不是连续的,而是随着每1次蜕壳间断增长,即不蜕壳时不增长,每蜕壳一次增长一次.孵化的一龄幼鲎大约经过180d的发育蜕去旧壳成为二龄幼鲎(图版Ⅱ:24;图版Ⅲ:25,26,27,28,29,30).3讨论3.1影响卵裂孵化的因素本实验中用以人工授精的卵约有10000粒,以观察受精后2～3d内是否出现卵裂现象作为受精与否的标志,计算受精率约为70%～80%,但最终孵化的只有40只幼鲎,孵出率约为0.4%,远远低于其他学者的报道结果,可能的主要原因有以下几点:3.1.1人工精授时间安排厦门地区的中国鲎一般最早在4月下旬产卵,8月底是尾声,9月初基本结束,其中立夏至处暑大量亲鲎的性腺成熟,从而进入产卵最盛期.本实验的人工精授安排在10月31日进行,不是在亲鲎产卵最佳时机,雌亲鲎体内的适于受精的卵减少.这提示厦门地区中国鲎人工授精育苗试验应安排在立夏到处暑这段时间.结合其它因素,这段时间也是最合适的,因为过早则水温偏低,影响胚胎发育;过迟又错过亲鲎的繁殖旺季,授精成功率大大降低.3.1.2精卵液的配制授精操作的人手不足,且操作不熟练,使精卵收集长达近1h,可能部分成熟精卵在操作中已经失活.授精用的混有精子的体液用等量的海水稀释后,倒入铺卵子的盛有1/3海水的托盘,混匀,精子的密度小,影响受精率.洗鲎卵时次数过多,一部分卵被洗坏了,也许是后期大量卵坏死的原因,(图版Ⅰ:3).这提示授精操作人员不应少于3人,收集精卵速度要快.卵子的清洗动作要轻柔,且清洗次数不宜多于4次.建议收集的雄鲎体液倒入铺卵的托盘前应将托盘的海水倒掉一半,使受精时精子的浓度相对大些,提高受精成功率.3.1.3海水淡化原因中国鲎的卵是中黄卵,内含有充分的养分可供养胚胎发育时消耗,然而胚胎的发育尚需从外界吸取水分和氧气,同时对底质、温度、孵育密度有一定的要求.自然界中鲎卵一般产在沙质的高潮线附近的地方,卵埋在高潮线附近,1天2次高潮时被淹没在海水中,时间相当短,而且沙缝的水分随着1天2次潮更换两次.卵周围的沙子犹如一层保湿层,潮水落去时,沙层能够保持水分使卵不会干燥,而且低潮时卵可吸收足够的热量,保证发育.低潮时沙缝里充满小小的气泡,当涨潮时卵被沙缝里冒出来的富氧海水冲洗.卵周围的沙层的这种保水换水保温换气的机制非常有利于鲎的胚胎发育.本次实验用的是塑料托盘作为孵育底质,放在28℃的恒温箱中,没有增氧措施,又由于新鲜沙滤海水供应不足,每天没有保证两次新鲜海水的更换,孵育卵的密度大,使孵育中的卵可能供氧不足.这可能是低孵化率的又一大原因.这提示受精卵的孵育中温度、氧气、水量是决定授精育苗成功率的三大因素.3.2月子激学和分子发精并存本实验值得一提的是对照组未受精卵几乎70%也有“卵裂”现象.从雌鲎体内取出的未受精卵用海水洗净,与受精卵同等条件孵育,迟于受精卵1～2d内出现与受精卵相同的卵裂现象,甚至发育到“囊胚期”,而后发育停