基于玻碳电极的甲胎蛋白安培免疫传感器的研究

基于玻碳电极的甲胎蛋白安培免疫传感器的研究

甲基苯丙胺是一种由590个氨基酸组成的单链糖蛋白。主要存在于肝肿瘤、尿黄囊肿和其他肿瘤患者的血清中。正常成人血清中AFP含量很少,高于20ng/ml就有肝肿瘤的可能,因此,痕量检测AFP具有重要意义。目前报道的AFP检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、表面等离子体谐振(SPR)、化学发光、电化学发光、放射免疫和时间分辨荧光免疫分析法。然而这些方法具有放射危害、耗时长、人员要求高、需要昂贵仪器等缺点。电化学免疫传感器由于具有操作简单快捷、灵敏度高、特异性好、价格低廉等优点成为甲胎蛋白等肿瘤标志物新的检测方法。应用纳米材料修饰电极可以提供传感器的灵敏度,目前文献报道的纳米修饰材料有碳纳米球、二氧化硅、纳米Pt、二氧化锰、石墨烯、碳纳米管(CNTs)、纳米金(nano-Au)等。其中CNTs由于具有良好的力学和电学性质倍受青睐;nano-Au由于其良好的生物相容性而广泛用于抗体或抗原的固定修饰。本研究在碳纳米管修饰的玻碳电极上,利用表面带正电荷的硫堇与带负电荷DNA直接的静电作用,利用层层自组装技术多层修饰硫堇以增强检测信号,同时利用纳米金固定甲胎蛋白抗体,制备了无酶型新型甲胎蛋白安培免疫传感器,为甲胎蛋白的痕量检测提出了新的方法。1材料和方法1.1甲胎蛋白及培养基抗体检测CHI842C电化学工作站(上海辰华公司);三电极体系:铂电极为对电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极;多层碳纳米管(CNTs)购自中国科学院成都有机化学有限公司;甲胎蛋白单克隆抗体及甲胎蛋白购自郑州博赛生物公司;硫堇、柠檬酸三钠、氯金酸、N,N-二甲基甲酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)均购自上海国药试剂;牛血清白蛋白、小牛胸腺DNA购自美国Sigma公司;其余试剂均为分析纯。缓冲液(PBS)为0.1mol/LKH2PO4配置,用NaOH调节不同pH值。1.2方法1.2.1纳米金的合成参考文献:0.45×10-3mol/L柠檬酸钠溶液加入煮沸的0.25×10-3mol/LHauCl4溶液中,剧烈搅拌,约10min后变成酒红色,表示纳米金合成,持续搅拌30min,冷却后备用。1.2.2修饰电极的制备将直径为3mm玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μmAl2O3在抛光布上打磨,然后依次用乙醇和超纯水超声清洗(每次清洗3～5min),这样就可得到一个平滑光洁新鲜的电极表面。电极修饰过程如图1:(1)5μlCNTs(2mg/ml)滴加在玻碳电极表面,自然干燥;得到碳纳米管修饰电极(CNTs/GCE),(2)电极浸泡在(0.2mmol/L)EDC/(0.1mmol/L)NHS2h后取出;(3)迅速将其浸入3mmol/L的硫堇溶液中3h,超纯水清洗;(4)电极干燥后,10μlDNA(10mg/ml)滴在电极表面,4℃冰箱作用4h;水洗,干燥;重复步骤(3)、(4),直至硫堇氧化还原峰电流达到最大值;(5)电极浸入上述制备的金胶溶液中,过夜,超纯水洗涤,干燥;(6)电极浸入抗甲胎蛋白抗体溶液中,4℃冰箱过夜孵育,洗涤,最后用BSA室温孵育40min,封闭未结合位点。制备的电极放4℃冰箱保存。1.2.3电化学检测将制备的电极插入标准品或病人血清中,室温反应后取出,用PBS轻轻洗涤,除去非特异性结合甲胎蛋白,然后将电极放在盛有PBS的反应池中,在CHI842C电化学工作站上检测。2结果2.1电极表面氧化还原信号通过循环伏安法表征了不同阶段修饰电极的电化学性质(图2A),在pH7.0的PBS中,与裸电极(a)相比,碳纳米管修饰电极(b)背景电流显著增加,说明碳纳米管能够增加电极有效面积,增加导电性。图2B显示的是电极层层修饰硫堇过程(1～5层),可以看出,通过层层自组装技术修饰硫堇后,随着层数的增加,电极表面氧化还原信号不断增加。在第5层信号达最大值。电极表面修饰硫堇后(图2A,c),硫堇分子的氨基可以进一步固定纳米金原子,由于纳米金可以促进电极表面的电子传递,电极表面氧化还原信号进一步上升(图2A,d);电极表面吸附甲胎蛋白单克隆抗体后,由于抗体阻碍电极表面的电子传递,电极表面信号下降(图2A,e);用BSA封闭电极表面剩余活性位点后(图2A,f),电极表面信号进一步下降。图3显示的是制备电极在0.1mol/LPBS溶液中在不同扫速下(有内至外):10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、500mV/s伏案特性曲线,内插图为扫速与峰电流线性关系。从图3可以看出,阳极峰和阴极峰电流均随扫速增加而成线性增加,即电极表现出明显的表面控制过程。2.2免疫反应最佳ph的测定免疫分析结果主要受缓冲溶液pH值、温育时间等条件影响。如图4A,在pH小于7.0时,免疫反应信号随pH增大而增大,在pH大于7.0时,免疫反应信号随pH增大而减小,故pH7.0是免疫反应的最佳pH值;图4B显示的免疫反应信号随反应时间增加而改变情况,在反应时间达25min时,信号趋于稳定,考虑节约检测时间因素,选择25min作为传感器最佳检测时间。2.3胎蛋白的检测在优化的条件下,制备的新型甲胎蛋白安培免疫传感器对甲胎蛋白的检测显示:在0.5～25ng范围内,传感器还原峰电流与甲胎蛋白浓度对数值成正比,检测限达0.02ng/ml。线性相关系数r=0.995(图5)。2.4方法的精密度取不同时间、不同批次制备的免疫传感器,对2ng/ml和10ng/mlAFP重复检测3次,获得的组内相对标准偏差为3.2%和4.5%,说明其具有良好的精密度。血清中主要的干扰物是具有电活性的物质,如离子、多巴胺、L-半胱氨酸、尿酸等,研究表明10～100倍以上上述干扰物浓度对检测无影响,说明传感器的抗干扰能力强。3甲胎蛋白的检测方法肿瘤标志物是癌细胞产生和释放的某些物质,常以抗原、酶、激素、代谢产物的形式存在于肿瘤细胞内或宿主体液中,根据其生化或免疫特性可以识别或诊断肿瘤。理想的肿瘤标记物应具有高特异性,适于人群普查。肿瘤标志物的血清学筛查可以简便地诊断癌症。就原发性肝癌而言,甲胎蛋白仍是特异性最强的标志物和诊断肝癌的主要指标。现已经广泛用于肝细胞癌的普查、诊断和判断治疗效果、预测复发。目前,临床上常规的甲胎蛋白检测方法主要有ELISA、化学发光、电化学发光法等。ELISA虽然成本较低,可对人群进行大规模筛查和普查,但是耗时较长(大于1h),无法做到快速诊断和床旁诊断;化学发光和电化学发光法需要昂贵的发光试剂和检测仪器,检测成本较高,不利于人群普查。电化学免疫传感器由于具有操作简单快捷、灵敏度高、特异性好、价格低廉等优点成为检测甲胎蛋白等肿瘤标志物极具潜力的新方法。本实验采用层层自组装技术在多层碳纳米管修饰的玻碳电极表面修饰了多层硫堇,进而利用硫堇分子表面的氨基固定纳米金原子,以此来固定抗甲胎蛋白单克隆抗体,从而制备了可以实现对甲胎蛋白快速检测的新型安培免疫传感器。该传感器在