微生物限度检查方法及其验证报告

文献编号：73021微生物程度检查办法及其验证报告目录1样品有关信息基本信息2重要仪器设备和实验耗材信息重要使用的仪器设备实验用培养基实验用试剂实验用菌种3实验环境无菌室干净工作台生物安全柜4实验方案验证明验目的微生物程度检查办法草案5办法验证明验菌液制备计数培养基合用性检查控制菌检查用培养基使用性检查供试液制备办法验证菌落计数办法验证明验控制菌检查办法的验证办法验证结论6供试品微生物程度检查成果1样品有关信息基本信息（三批）品名多烯酸乙酯软胶囊或蛹油α-亚麻酸乙酯胶丸规格粒，30粒/瓶或粒，30粒/瓶批号2重要仪器设备和实验耗材信息重要使用的仪器设备仪器名称型号编号培养箱HH·BⅡ·360ZL-025MJX-150ZL-042SPX-150BZL-046JJ-5ZL-026电子天平JY1001ZL-013超净工作台JH-DCBZL-028生物安全柜BSC-1100ⅡA2ZL-029实验用培养基对照培养基培养基名称批号生产厂家胰酪大豆胨琼脂培养基中国食品药品检定研究院胰酪大豆胨液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基RV沙门增菌液体培养基实验用培养基培养基名称配制批号胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基RV沙门增菌液体培养基实验用试剂试剂名称配制批号含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液含%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液%氯化钠1%红四氮唑实验用菌种菌种名称菌种编号工作用菌种批号及代数信息大肠埃希菌CMCC（B）44102E3-02枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501E3-02金黄色葡糖球菌CMCC（B）26003E3-02乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094E3-02白色念珠菌CMCC（F）98001E3-02黑曲霉CMCC（F）98003E3-023实验环境《中国药典》规定，微生物程度检查应在环境干净度10000级下的局部干净度100级的单向流空气区域内进行。我司微生物程度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台干净度检测无特殊状况下每季度进行一次。无菌室无菌室按《医药工业干净厂房设计规范》GB50457-监测，静态干净度检测成果符合GB50457-对10000级干净度规定。超净工作台超净工作台按《医药工业干净厂房设计规范》GB50457-监测，静态干净度检测成果符合GB50457-对100级干净度规定。超净工作台沉降菌检测统计沉降菌落数左0中0右0空白对照0生物安全柜生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-监测，静态干净度检测成果符合GB50457-对100级干净度规定。生物安全柜沉降菌监测统计沉降菌落数左0中0右0空白对照04实验方案按《中国药典》第四部：（通则1105）非无菌产品微生物程度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物程度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物程度原则及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物程度原则为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。验证明验目的确认所采用的办法适合于本品的微生物程度检查。即确认本品在该检查量及该检查条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充足消除到能够无视不计。确保检查成果的精确、可靠及检查办法的完整性。微生物程度检查方案对三批产品进行3次独立的平行实验。取本品10g，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1：10的供试液。取1：10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至9ml，即为1：100的供试液。微生物计数法，取1：10的供试液1ml，注入平皿中，依法检查（中国药典四部通则1105）；控制菌检查法，取1：10的供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法检查（中国药典四部通则1106）。5办法验证明验对上述非无菌产品微生物程度检查办法方案进行验证。菌液制备（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天。上述培养物用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液。（2）接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3ml%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，过滤菌丝吸出孢子悬液至无菌试管内，用%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数不大于100cfu的孢子悬液。计数培养基合用性检查（实验时间：）取上述制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液各1ml（不大于100cfu），分别注入无菌平皿中，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置30～35℃培养3～5天，计数；取上述制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml（不大于100cfu），分别注入无菌平皿中，立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置20～25℃培养5～7天，计数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。若被检培养基上的菌落平均数不不大于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基的菌落一致，判该培养基的合用性检查符合规定。实验成果如表1：表1培养基合用性检查成果金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠埃希菌黑曲霉白色念珠菌对照培养基12平均被检培养基12平均回收率%菌落形态大小与否一致成果判断控制菌检查用培养基合用性检查（实验时间：）控制菌（大肠埃希菌）检查用培养基合用性检查麦康凯液体培养基促生长能力和克制能力检查：接种不不不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，在42～44℃培养24～48小时，成果见表2。接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培养基中，在42～44℃培养24～48小时，成果见表2。麦康凯琼脂培养基促生长能力和批示特性检查：接种不不不大于100cfu的大肠埃希菌与被检培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～72小时，成果见表2。表2控制菌检查用培养基合用性检查成果检测项目培养基实验用菌促生长能力克制能力批示特性对照培养基被检培养基对照培养基被检培养基对照培养基被检培养基大肠埃希菌麦康凯液体培养基大肠++////金葡//++//麦康凯琼脂培养基大肠++//++结论注：表中“+”标示有能力，“-”标示没有能力，“/”标示不规定做供试液制备（实验时间：）取本品10g，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1：10的供试液。取1：10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1：100的供试液。办法验证（实验时间：）菌落计数办法验证明验（1）菌液组：分别取菌液1ml，采用平皿计数法，测定上述备好的菌液中每毫升的活菌数，测定成果见表3。（2）供试品对照组：取1：10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试品本底的需氧菌总数，测定成果见表4。取1：10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试液品本底的霉菌和酵母菌总数，测定成果见表4.（3）实验组：取1：10的供试液1ml和上述控制菌菌液1ml（不大于100cfu实验菌）分别注入同一平皿中，测定成果见表5，回收率见表6。另取1：10的供试液的供试液1ml和上述真菌菌液1ml（不不不大于100cfu实验菌），分别注入同一平皿中，测定成果见表5，回收率见表6。（4）稀释剂对照组：取1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml分别注入平皿中，测定成果见表7。上述已注入供试液的平皿（其中实验组在注入供试液和控制菌菌液后应立刻倾注培养基），需氧菌总数，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养3～5天逐日观察成果，霉菌和酵母菌总数，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，待凝固后，置20～25℃培养5～7天逐日观察成果。表3菌液组菌落计数（cfu/皿）大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉12平均表4供试品对照组菌落计数（cfu）实验次数需氧菌总数霉菌和酵母菌总数1ml平均1ml平均123表5实验组菌落计数（cfu）实验次数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉112平均212平均312平均表6实验组回收率测定成果实验次数回收率%大肠埃希菌金色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉123表7稀释液对照组实验次数无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液123平均经上述实验验证，采用上述办法方案进行本品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数可使用回收率达成规定。控制菌检查办法的验证（实验时间：）菌液制备接种大肠埃希菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24小时。用%无菌氯化钠溶液9ml制成每1ml含菌数为10cfu~100cfu菌悬液。大肠埃希菌检查办法的验证（1）供试品组：取1：10的供试液10ml，加至胰酪大豆胨液体培养基100ml中，置33℃培养24小时。（2）阴性对照组：取稀释液10ml，加至胰酪大豆胨液体培养基100ml中，置33℃培养24小时。（3）取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，置43℃培养24小时，观察成果，见表7。表8大肠埃希菌检查成果大肠埃希菌胰酪大豆胨液体培养基麦康凯液体培养基供试品组阴性对照组表8成果显示，表明本品在该条件下对大肠埃希菌无抑菌作用或其抑菌作用能够无视不计。阐明采用该法进行本品的大肠埃希菌检查可行。办法验证结论上述验证明验成果证明，非无菌产品微生物程度检查办法方案可行。根据验证成果，制订非无菌产品微生物程度检查办法以下：微生物程度取本品10g，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，使供试品分散均匀，制成1：10的供试液。必要时，取1：10的供试液1ml，置含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至9ml中，即为1：100的供试液。需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，分别取1：10的供试液1ml，