好氧反硝化菌的脱氮作用及应用研究进展

好氧反硝化菌的脱氮作用及应用研究进展

在氮生物循环中，反硝化作用是一个重要的环节。传统的脱氮理论认为，为了实现废水的生物脱氮，有必要通过典型的硝化作用和反硝化。废水中的铵氮首先被氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌氧化，然后在好氧条件下氧化亚硝酸盐和亚硝酸盐。在厌氧或兼职氧的条件下，亚硝酸盐氮被转化为氮或氮。抗硝化菌在氧气条件下优先考虑氧气作为电子受体。只有在氧气条件下，亚硝酸盐才能取代氧气作为最终的电子受体进行反硝化。近年来，新的氮脱氮生物的发现给人们带来了新的认识，其中之一就是要发现好氧反硝化菌。好氧反硝化菌是在氧气条件下通过良好反硝化酶进行反硝化的一种新的抗硝化菌。这一发现打破了抗硝化只能在氧气条件下进行的传统观点，为新生物的脱氮创造了新思路。本文从善氧反硝化菌的脱氮特性、作用机制和影响因素两个方面介绍了善氧反硝化菌的研究、发展和应用现状。1菌株筛选及脱氮特性关于好氧反硝化菌的研究始于20世纪80年代,Robertson和Kuene在除硫和反硝化处理系统中首次分离到好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha(现更名为Paracoccuspantotrophus)、Pseudomonasspp.及Alcaligenesfaecalis.之后很多人采用类似的方法筛选出了此类脱氮菌.近几年,随着对好氧反硝化作用的日益关注,陆续有很多具有好氧反硝化能力的新菌株被报道,如Klebsiellapneumoniae、Comamonastestosteroni、Pseudomonasputida.现已报道的好氧反硝化细菌大多分布在假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)和产碱菌属(Alcaligenes)等土壤、废水常见菌属中,其具体脱氮特性详见表1.2反硝化菌引起的电子最终受体目前,关于好氧反硝化菌的作用机理主要是通过对经典好氧反硝化菌株Thiosphaerapantotropha的研究得到的,现被大多数学者认同的好氧反硝化机理是由Robertson等提出的协同呼吸理论.协同呼吸意味着在反硝化过程中,分子氧和硝酸盐同时作为最终电子受体,即反硝化菌可以将电子从被还原的物质传递给氧气,同时也可以传递给硝酸盐.在细胞色素c和细胞色素aa3之间的电子传递链中的“瓶颈现象”就可以克服.因此也就允许电子流同时传输到反硝化酶以及分子氧中,反硝化反应就可能在好氧环境中发生.根据Wilson等提出的细菌反硝化过程电子传递模型(图1)可以看出,NO3-和O2均可作为电子最终受体,反硝化菌可将电子从被还原的物质传递给O2,同时也可通过硝酸盐还原酶将电子传递给NO3-.2.1好氧反硝化酶系中的关键酶由于T.pantotropha好氧反硝化现象发现较早,因此有关好氧反硝化酶系的研究也主要是围绕此菌展开.好氧反硝化过程中主要涉及到的关键酶依次是硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶.2.1.1两种酶的活性研究在T.pantotropha中表达两种异化性硝酸盐还原酶,即膜质硝酸盐还原酶(membrane-boundnitratereductase,NAR)和周质硝酸盐还原酶(periplasmicnitratereductase,NAP).菌体的好氧生长和厌氧生长直接影响了这两种酶的活性.在缺氧条件下,NAR表达占主导地位,而且仅仅在厌氧条件下才能发挥作用;在好氧条件下NAP表达占主导地位,并且在好氧和厌氧条件下都能发挥作用.厌氧条件下,NAP也会有所表达.好氧反硝化的能力被与NAP的表达联系在一起,代替了厌氧反硝化菌通常表达的NAR.氧气被认为通过阻止硝酸盐进入NAR的催化中心而参与调控硝酸盐呼吸作用,但NAP的催化活性中心在细胞膜外,因此氧气对硝酸盐-亚硝酸盐转运系统的阻碍作用被解除了.研究表明:NAP由一个90kDa的钼喋呤结合催化亚基(NapA)和一个16kDa的细胞色素c552(NapB)构成,后者含有两个血红素基团.与NAR相比,NAP对硝酸根有更高的底物专一性,并对叠氮化物的抑制不敏感.2.1.2cytcd1型亚硝酸盐还原酶亚硝酸盐还原酶是反硝化途径的关键酶.亚硝酸盐至NO的还原反应是反硝化作用区别于其他硝酸盐代谢的标志性反应,该酶的基因也是在反硝化菌功能基因中被研究最多的,已经作为反硝化菌的分子标记而用于其种群结构及多样性的研究.亚硝酸盐还原酶分布于细胞膜外周质中,有两种类型:一种为含c和d1型血红素的二聚体,称为Cytcd1型亚硝酸盐还原酶,能将亚硝酸盐转化为NO和NO2;另一种为三聚体,含Cu催化中心,称为Cu型亚硝酸盐还原酶,产物是NO.Moir等从P.pantotropha提纯了Cytcd1型亚硝酸盐还原酶,分子量约为63kDa,并且推测假天青蛋白在体内作为其电子供体.Fulop等发现P.pantotropha中的细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶是一种具有两种截然不同功能的酶,这种酶既可以催化亚硝酸盐得到一个电子还原成NO,又可以催化O2得到4个电子转化成水.由于亚硝酸盐和NO可产生活性氮(RNS),会对细胞产生毒害.Doi等通过对耐高浓度亚硝酸盐菌株OchrobactrumanthropiYD50.2的研究表明,其Cu型亚硝酸盐还原酶基因和NO还原酶基因成簇分布在一起,推断Nir-nor作为一对刺激影响因子会对RNS做出快速应答,以解除其对细胞的毒害作用.2.1.3no氧还原酶NO还原酶结合于细胞膜上,由两个亚基构成,分子量分别为34kDa和15kDa.每分子含有两个亚铁血红素b和一个亚铁血红素c,未发现铜原子.光谱特性表明,其中一个亚铁血红素b和亚铁血红素c处于6配位的低自旋状态,而另一个亚铁血红素b处于5配位的高自旋状态,可以和CO反应.在亚铁细胞色素c550作为电子供体的条件下,此酶显示出很高的细胞色素c型NO氧还酶活性,并将NO转化为了N2O.NO还原酶对NO具有很高的亲和力,将有限的电子集中用于NO还原,使NO浓度维持在极低的水平,避免了NO对生物体的毒性影响.2.1.4财聚体还原no(nitrousoxidereductase,NOS)N2O至N2的还原反应是由N2O还原酶催化的.好氧反硝化菌的N2O还原酶位于细胞膜外周质,是分子量67kDa的铜型二聚体,不含血红素基团.Bell等认为,在有氧条件下,T.pantotropha细胞N2O还原酶具有活性,能将NO、N2O两种气体同时还原,但二者会相互抑制.Berks等从好氧和厌氧生长的T.pantotropha细胞中提纯了N2O还原酶,发现其在分子特性上与从厌氧反硝化微生物中提取的一氧化二氮还原酶具有相似之处.T.pantotropha和Rhodobactercapsulatus的N2O还原酶活性并不受氧抑制,在有氧情况下,P.pantotropha能够把N2O还原成N2.由此可见,只要能获得电子,N2O的还原反应就能进行.2.2氧反硝化菌株抗氧化酶系统溶解氧浓度(DO)、碳氮比(C/N)、温度、pH值通常被认为是反硝化作用的关键限制性因素,但是不同的菌种、反应器及环境条件使这些因素的影响效果不尽相同.近几年的研究成果显示,DO和C/N是影响好氧反硝化活性的主要因素.2.2.1DO根据多年来报道的好氧反硝化菌来看,不同菌属的好氧反硝化菌对氧气的耐受能力差异显著.大部分好氧反硝化菌在DO浓度3mg·L-1以下具有反硝化活性(表1).DO浓度对反硝化菌的影响主要有两大类型.第一种,在一定范围内,反硝化速率不受DO值的影响.但是当DO值降低到某个值时,反硝化酶系的活性开始急剧上升,反硝化率随着DO值的降低而较大幅度地升高,这就是所谓的阈值.Patureau等在研究好氧反硝化菌株Microvirgulaaerodenitrificans时发现:当DO浓度高于4.5mg·L-1时,对该菌株的反硝化速率没有影响;当DO浓度低于4.5mg·L-1时,随着溶氧浓度的下降,反硝化率大幅度的升高.另一种情况是Huang等在研究好氧反硝化菌Citrobacterdiversus时发现的,该菌株在DO为5mg·L-1时反硝化速率最高,溶氧的降低和升高都会导致反硝化速率和细胞生长速率的下降.在阈值以上,反硝化速率保持在一个较低的水平,原因可能是由于在此DO浓度以上,氧气对于反硝化酶有抑制作用,因此反硝化酶的合成与活性被控制在一个较低的水平.目前关于氧气对硝酸盐还原的抑制作用方式的研究主要有以下几种结论:1)与硝酸盐竞争电子;2)阻止反硝化酶的合成;3)阻止硝酸盐转移到硝酸盐还原酶作用位点.2.2.2C源与C/N目前发现的绝大多数好氧反硝化菌是异养菌,很多以有机碳作为能源.由于代谢机理、电子传递途径的差异,所需的碳源和C/N呈现多样性.一些研究证实,在一个适当的范围内,作为能源的碳源浓度越高,好氧反硝化速率越快.Richardson和Ferguson的研究发现,周质硝酸盐还原酶的活性很大程度上取决于碳源,T.pantotropha在以丁酸盐和己酸盐作为碳源时酶活最高,醋酸为碳源时次之,苹果酸盐和琥珀酸盐为碳源时最低.Huang等的研究发现,以醋酸盐作为碳源,C/N为5时,C.diversus反硝化速率最大,并随着C/N的增大反硝化速率下降.Kim等通过对P.putidaAD-21的研究发现,醋酸盐、琥珀酸盐和葡萄糖都是很好的碳源,甲醇和乙醇作为碳源时反硝化活性不高,在C/N为8时表现出最高的反硝化活性.因为反硝化本身是个氧化还原反应,碳源氧化还原电位的不同会对反硝化作用产生不同影响.另外,碳源不足会导致菌体的生长受限,反硝化过程酶系合成不完全,造成中间产物的积累使反硝化不彻底.3好氧反硝化菌的主要特征3.1异养硝化菌的抗氧化酶系统好氧反硝化菌的另一个特点是大多表现出异养硝化能力.这种硝化与反硝化作用的偶联意味着铵态氮在好氧条件下可直接转化成气态产物.T.pantotropha的硝化过程与自养菌不同,其硝化作用是一个耗能反应,硝化速率随着溶解氧降低而增加,在溶氧浓度达到空气饱和溶氧浓度的25%时达到最大.因为偶联的异养硝化-好氧反硝化产生的能量要比自养硝化和反硝化产能更少,因此有人推测好氧反硝化菌的异养硝化作用在对还原性的碳源进行氧化的代谢过程中起着驱散多余还原力的作用.参与异养硝化的酶包括氨单加氧酶(ammoniamonooxygenase,AMO)和羟胺氧化酶(hydroxylamineoxidase,HAO).3.2好氧反硝化菌株的筛选好氧反硝化菌较传统反硝化菌的一个特点是产物主要为N2O,由于N2O生成的机理很复杂,目前对其代谢机制的认识还不够全面.有观点认为N2O还原酶对氧气很敏感,N2O在低溶解氧浓度下会取代N2成为反硝化的最终产物.还有研究报道,好氧反硝化过程中C/N较低、DO浓度低、SRT(污泥停留时间)小都会导致N2O的累积而使其释放量增大.Takaya等筛选出两株反硝化细菌TR2和K50,在好氧条件下产生少量的N2O.刘晶晶等通过对一株产生低水平N2O的好氧反硝化菌Delftiatsuruhatensis的研究发现,对该菌株N2O气体的产生影响最大的因素为C/N,其次为DO和pH.如何优化反应条件,降低中间产物积累,筛选N2O产量低的好氧反硝化菌已成为真正意义上实现生物脱氮的关键所在.3.3过滤方法好氧反硝化细菌由于其非典型特性,在环境中不易成为优势菌,因此采用一般筛菌方法不易将其筛选出来.3.3.1好氧反硝化菌的选育目前,好氧反硝化菌的驯化主要采用间歇曝气法.大部分研究者认为,好氧/缺氧环境的频繁转换使得完全好氧菌和厌氧菌不能正常生长,增加了好氧反硝化菌转变为优势菌的可能性,另外高C/N有助于好氧反硝化菌的筛选.Patureau等利用间歇曝气法对取自不同地点的样品进行了长期驯化,分离筛选出了10株好氧反硝化菌.Wang等对SBR反应器的活性污泥采用间歇曝气并增大溶氧浓度(DO2.2～6.1mg·L-1)的方式进行驯化,成功实现了好氧反硝化菌的富集.3.3.2好氧反硝化细菌的富集孔庆鑫等通过向反硝化培养基中加入氰化钾(KCN),同时对培养基曝气来筛选好氧反硝化菌.KCN可终止呼吸链中电子向氧分子的传递,从而抑制利用氧作为电子受体的呼吸反应,同时曝气状态下,氧分子又抑制了厌氧条件下起作用的酶(如膜质硝酸盐还原酶),在这种条件下,好氧反硝化细菌得到富集.Takaya等根据反硝化过程产碱这一特性,设计了pH指示剂培养基,即通过向反硝化培养基中加入酸碱指示剂溴百里酚蓝(pH6.2～7.6;黄-蓝),当培养基颜色由初始的绿色(pH7.2)变为蓝色时即表示可能进行了反硝化作用,初步认定为好氧反硝化菌.4好氧反硝化菌的生物学特性随着近代生物学的发展和人们对生物技术的掌握,脱氮技术已由单纯工艺改革向着以生物学特性促进工艺改革的方向发展,从而实现高效低耗.好氧反硝化菌凭借其独特的生物学特性而在很多领域得到重视利用,一些以之为基础的新型脱氮工艺也应运而生.4.1亚硝酸盐同步硝化反硝化技术好氧反硝化菌的发现,奠定了同步硝化反硝化工艺(simultaneousnitrificationanddenitrification,SND)的生物学基础.所谓的同步硝化反硝化就是在一个具有好氧条件的反应器内同时完成硝化和反硝化作用.在废水处理方面,同步硝化反硝化相对于传统的生物脱氮工艺具有明显的优势.首先在同一个反应器内实现硝化反硝化和除碳不仅使得反应器程序简易(好氧条件较厌氧条件更容易控制),而且降低了操作难度及运行成本;其次,反应速率大幅提高.硝化过程的产物亚硝酸盐和硝酸盐可以直接作为反硝化的底物,避免了硝化产物的累积,并且如果能将硝化过程控制在亚硝酸盐阶段,即硝化作用产生的亚硝酸盐直接进行反硝化,就可以实现亚硝酸型同步硝化反硝化;最后,稳定反应器的pH值.反硝化过程产碱,可以部分补偿硝化过程所产的酸,降低外加碱的费用,并且减少二次污染.2001年,Gupta等用含有T.pantotropha混合微生物膜的生物转盘(rotatingbiologicalcontactor,RBC)处理不同浓度的生活污水时,在有机负荷在10.0～32.0gCOD·m-2·d-1和铵态氮负荷在1.0～3.35gN·m-2·d-1的情祝下,COD和铵态氮去除速率高达8.7～25.9gCOD·m-2·d-1和0.81～1.85gN·m-2·d-1,在好氧条件下实现了有机物和氮的同步高效去除.Joo等利用粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)No.4在好氧状态下处理高有机负荷(12000CODmg·L-1)和高铵态氮负荷(2000mg·L-1)的猪舍废水,铵态氮去除速率达到30mg·L-1·h-1,且好氧反硝化率超过65%.在控制一定的C/N和pH值的连续处理状况下,COD和铵态氮的去除率达到100%.在Kshirsagar等的研究中,使用两个操作条件完全相同的氧化沟来处理模拟肥料工业废水,比较在有T.pantotropha和无T.pantotropha时的脱氮速率,当进水总凯氏氮(totalKjeldahlnitrogen,TKN)的质量浓度为790mg·L-1时,含有T.pantotropha的氧化沟系统中硝化段的TKN去除效率和反硝化段的总氮(totalnitrogen,TN)去除效率分别比对照系统高出10%和20%,由此可见T.pantotropha在异养硝化和好氧反硝化方面具有的重要作用.4.2好氧反硝化细菌养殖水体的最大特点是,铵态氮和亚硝态氮含量较高,而这两种氮素对鱼虾的危害最大,因此铵盐和亚硝酸盐的有效去除是养殖水体修复的关键.另外水产的高密度养殖要求必须连续地充氧以保证水中溶解氧含量,实际生产中养殖水体的溶氧浓度一般应保持在4～8mg·L-1.基于以上两个特点,人们将目光转向了好氧反硝化细菌.好氧反硝化菌生长速度快,有氧条件下具备反硝化能力,并且与传统的化学自养硝化菌不同,好氧反硝化菌多数也是异养硝化菌,可将氨在好氧条件下直接转换成气态产物.另外,咸水鱼的养殖水体具有一定含盐量,具有耐盐特性的好氧反硝化菌株的选育为探寻养殖水体水质净化提供了新思路,具有重要社会经济意义.廖绍安等从养虾池悬浮生物膜中分离的嗜麦芽寡养单胞菌在溶氧浓度3.80～5.12mg·L-1条件下,可在10h内将亚硝酸盐从26.18mg·L-1还原至0,同时该菌株在盐度0～20之间显示出较高的反硝化活性.于爱茸等从鱼塘中分离得到一株高效好氧反硝化芽孢杆菌,对高浓度亚硝酸盐具有很强的降解能力.张小玲等将分离到的好氧反硝化菌H2投入模拟养殖水体,脱氮效果明显.4.3好氧反硝化菌的降解好氧反硝化菌在废气处理、污染物降解方