等吸收紫外光度法测定槐米提取物中的芦丁和槲皮素

等吸收紫外光度法测定槐米提取物中的芦丁和槲皮素

1芦丁、槲皮素的测定蝗虫是豆科植物的干燥花和花蕾。槐米又称槐花米,凉血止血,用于血热所致的各种出血症。尤宜于大肠火盛,温热郁结引起的便血、痔血等下部出血症。本品因含有芦丁和槲皮素等黄酮类生物活性物质,能降血压及改善毛细血管的脆性,近年来,常用于高血压症的治疗,是医药工业提取芦丁的常用药材。芦丁是制备槲皮素的主要原料,具有多方面的生理活性,有保持及恢复毛细血管的正常弹性,调节毛细血管壁渗透性的作用。临床上用于治疗过敏性紫癜及各种因毛细血管脆性增加而引起的出血性疾病,也用于治疗高血压和老年气管炎等。槲皮素用于治疗慢性支气管炎,对冠心病及高血压也有辅助治疗作用。同时具有明显的抗肿瘤、抗氧化及影响各种酶的活性等作用。芦丁和槲皮素的结构及临床上的作用很相似。两种物质往往共存,测定它们的含量时,相互之间有干扰,需经分离后才能进行测定,操作繁琐费时,误差较大。槐米中芦丁和槲皮素的测定,已有脉冲极谱法、高效液相色谱法、流动注射法、毛细管电泳-电化学检测法和卡尔曼滤波法等。本法不经分离,对槐米中的芦丁和槲皮素同时进行测定。其原理为:在等吸收波长处测定样品溶液的吸光度,其吸光度差值ΔA只与其中一种组分的浓度呈线性关系,而与另一组分的浓度无关。本法简便、快捷,精密度和准确度亦令人满意。2实验部分2.1主要试剂的配制751G分光光度计(上海分析仪器厂);756MC分光光度计(上海分析仪器厂);AB2004-N电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。槲皮素(中国预防医学科学院劳卫所,生化纯),用电子天平准确称取槲皮素4.2mg,用甲醇溶解,移入50mL的容量瓶中,用甲醇定容至刻度,浓度为84μg/mL。芦丁(国药集团化学试剂有限公司,生化纯),用电子天平准确称取芦丁4.3mg,用甲醇溶解,移入50mL的容量瓶中,用甲醇定容至刻度,浓度为86μg/mL;实验用水为蒸馏水。2.2评估芦丁、槲皮素在13、34分别配制槲皮素(8.04μg/mL)和芦丁(17.36μg/mL)的单组分标准溶液,测定它们在波长240—380nm的吸光度,经过粗选和细选,分别找出槲皮素和芦丁的等吸收波长λ1、λ2、λ3、λ4。由于槲皮素在λ1、λ2处有相同的吸收,在此二波长处混合物的ΔA只与芦丁的浓度有关。同理,在λ3、λ4处测定其吸光度,ΔA只与的槲皮素浓度有关。配制一系列浓度的槲皮素和芦丁标准溶液,在等吸收波长处测定其吸光度,计算吸光度的差值,作校准曲线及线性回归方程,由此可计算出未知物样品中芦丁和槲皮素的含量。3结果与讨论3.1稀碱稳定性的考察主要从芦丁和槲皮素样品的溶解度和稳定性考虑,选择稀碱(醋酸钠、氢氧化钠)水溶液、甲醇、不同比例的甲醇水溶液、乙醇实验。结果表明,样品不溶于醋酸钠溶液,稀氢氧化钠对待测物质的稳定性影响较大,很短时间就使芦丁、槲皮素溶液由黄色变为棕黄色。样品均能很好地溶于甲醇,芦丁在1∶4的甲醇水溶液中稳定性最好(约放置3h吸光度不会有大的变化)。槲皮素在1∶4的甲醇水溶液中能稳定1h,符合测定要求。样品在乙醇中溶解时需水浴加热,但在加热时,芦丁少部分发生水解,生成槲皮素和糖。本实验用甲醇溶解并配制样品,用1∶4的甲醇水溶液作为稀释液。3.2紫外分光光度计检测移取一定体积的芦丁和槲皮素储备液,经1∶4的甲醇水溶液稀释后,配制成芦丁8.04μg/mL、槲皮素17.36μg/mL的单组分标准溶液,经紫外分光光度计扫描测定,绘制相应的吸收曲线,同时确定槲皮素在波长247nm和266nm有相同的吸收,芦丁在波长340nm和370nm处有相同的吸收。具体情况如图1所示。3.3校准曲线测定配制一系列浓度的芦丁溶液,测定其在波长247nm和266nm的吸光度,计算其对应的吸光度差值,作出ΔA—C校准曲线。结果列于表1。校准曲线回归方程:ΔA=0.0147C+0.0058;相关系数r=0.9996。配制一系列浓度的槲皮素标准溶液,在波长340nm和370nm处测定其吸光度,计算相应的吸光度差值,结果列于表2。校准曲线回归方程:ΔA=0.0679C+0.0327,相关系数r=0.9993。3.4芦丁和槲皮素标准使用液移取2mL样品储备液,用1∶4的甲醇水溶液稀释至10mL,计算得到此溶液中含芦丁14.88μg/mL,槲皮素1.742μg/mL。在该溶液中加入不同比例的芦丁和槲皮素的标准溶液,测定后计算其回收率。结果列于表3。3.5芦丁含量测定结果称取50g槐米(本市药店所购)用蒸馏水浸泡10h后,用70%乙醇回流提取3次,过滤合并滤液,蒸馏回收乙醇,浓缩干燥得提取物。称取4.6mg提取物,用甲醇溶解,转移至50mL的容量瓶中,用1∶4的甲醇水溶液定容至刻度,制得样品储备液。移取2.0mL—4.5mL(间隔0.5mL)的样品储备液,配制成一系列浓度的样品溶液,在波长247nm和266nm下测定其吸光度值,并计算吸光度差值,用ΔA=0.0147C+0.0058计算芦丁的浓度,进而可以计算出样品中芦丁的含量。结果列于表4。移取2.0mL—4.5mL(间隔0.5mL)的样品储备液,配制成一系列浓度的样品溶液,在波长340nm和370nm下测定其吸光度值,并计算吸光度差值,用ΔA=0.0679C+0.0327计算槲皮素的浓度,进而可以计算出样品中槲皮素的含量。结果列于表5。4组分同