污水短程生物脱氮系统中硝化菌群的定性与定量化分析

污水短程生物脱氮系统中硝化菌群的定性与定量化分析

近年来，生物分子的快速发展为生物福利微生物的研究提供了一种新的分析技术和方法。通过传统的纯分离方法，可以分析和定量评估复杂微生物的结构。例如，对于生物福利的研究，有许多关于缩短反应的文献报告，例如对硫酸盐还原菌（kaneetal.1993）、线性菌（wagneretal.1994）、聚磷菌（cytstall，1998）、硝化菌（damiseal.，2001）等。短程脱氮是生物脱氮新理论和先锋科学的之一。对于实现短程脱氮的关键是限制硝化菌（aob）和nob（nitroll，1998）的结构分布和生物活性的动态变化。这是建立有效的调节机制的前提和基础。然而，另一方面，研究主要集中在对亚硝酸盐积累率的影响因素的研究上，对硝化菌群落（aob）的结构分布和动态变化非常重要。这是建立有效的控制机制的前提和基础。然而，在目前的研究中，我们主要集中在对亚硝酸盐积累率影响因素的研究上，我们很少参与短期脱氮过程中硝化菌群落的内部结构的分析，也没有明确的认识和理解“微生物”的直观和清晰的理解和理解（zhenghaial.，2004；maetal.，2004；刘秀红等，2004）。因此，在短程脱氮系统特征研究的基础上，需要进一步研究硝化菌群的结构组成和空间分布，为短程脱氮的优化控制策略奠定基础。1材料和方法杏仁1.1小型反应器中亚硝酸盐提取污泥样品来自于4种不同的污水短程生物脱氮系统.(1)SBR大型中试反应器:有效容积54m3,运行温度13℃,亚硝酸盐积累率95%,好氧HRT实时控制是实现短程脱氮的关键因素;(2)UASB-A/O小型反应器:A/O有效容积15L,亚硝酸盐积累率98%,高浓度的游离氨(FA)抑制和好氧HRT实时控制是实现短程脱氮的关键因素;(3)A/O中试反应器:有效容积300L,污泥龄15～20d,运行温度22～23℃,好氧区平均DO浓度0.57mg·L-1.亚硝酸盐积累率80%,经分析DO浓度和好氧HRT实时控制是实现短程脱氮的关键因素;(4)SBR小型反应器:有效容积12L,运行温度28℃,DO浓度2mg·L-1以上,亚硝酸盐积累率95%,温度和好氧HRT实时控制是实现短程脱氮的关键因素.除了UASB-A/O反应器处理实际垃圾渗滤液之外,其余3种反应器均处理实际生活污水.1.2杂交缓冲液和探针的制备按照Amann的操作方法进行Fish分析.采用4%PFA,4℃条件下对污泥样品固定2～3h.对固定后的污泥样品超声分散1min,将样品滴加在明胶包被过的载玻片上,空气中干燥后先后浸泡于50%、80%和98%的乙醇溶液中脱水3min.杂交缓冲液组成包括0.9mol·L-1NaCl、20mmol·L-1Tris/HCl,0.01%SDS和甲酰胺(甲酰胺FA浓度见表1),pH7.2.将荧光标记的寡核苷酸探针溶解于杂交缓冲液中,在46℃下与污泥样品杂交2h.采用的寡核苷酸探针列于表1.杂交结束后,采用洗脱缓冲液在48℃下洗脱20min.在干燥后的样品上滴加抗荧光衰减液,对每个污泥样品随机拍摄20～25张照片(OLYMPUSBX52荧光显微镜)用于定量分析(LeicaQWINSoftware).1.3pcr扩增条件及dage分析采用FastDNAspinkitforsoil(Bio101,USA)进行污泥样品的DNA提取.PCR引物采用AmoA-1F-Clamp(5’-Clamp-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3’)和AmoA-2R-TC(5’-CCCCTCTGCAAAGCCTTCTTC-3’),特异性扩增AOB.PCR混合液(50μL体系):35.5μLdH2O,5μLPCR缓冲液,1μL正向引物(50pmol·μL),1μL反向引物(50pmol·μL),0.5μL5UTaqDNA聚合酶,5μLdNTP(1.25mmol·L-1),2μLDNA模板.PCR反应条件:95℃下10min,35个循环(94℃下15s,55℃下20s,72℃下2min),最后72℃下延伸5min.采用DcodeSystem(BioRad)对AmoAPCR产物进行DGGE分析.分别准备2种变性剂浓度的凝胶溶液30%和70%,在100V、60℃、1×TAE缓冲液中运行15h.VistraGreen染色凝胶20min,然后在FluorImage595成像系统中进行观察.1.4pcr扩增条件PCR引物采用标准的AmoA-1F(5’-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3’)和AmoA-2R(5’-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3’),特异性扩增AOB.PCR混合液(50μL体系):1×PCR缓冲液,0.25μmol·L-1正向引物,0.25μmol·L-1反向引物,1.25UTaqDNA聚合酶,0.2mmol·L-1dNTPs.PCR反应条件与1.3节相同.2结果resource2.1a/o中试反应器中亚硝酸盐积累率80%,nob4种短程生物脱氮系统的Fish定量分析结果分别是:SBR大型中试反应器中(亚硝酸盐积累率95%)AOB为总菌群数的3%,没有检测出NOB;UASB-A/O小型反应器中(亚硝酸盐积累率98%)AOB占总菌群数的4%,NOB低于总菌群数的0.2%;A/O中试反应器中(亚硝酸盐积累率80%)AOB为总菌群数的5%,NOB低于0.2%;SBR小型反应器中(亚硝酸盐积累率95%)AOB为总菌群数的12%,没有检测出NOB.Fish定量结果表明,在亚硝酸盐积累率高于80%后,AOB在活性污泥中所占的比例与亚硝酸盐积累率没有明显的相关性,但AOB相比于NOB已成为明显的优势菌群,或者已实现从系统中淘汰NOB.Fish检测结果如图1、图2所示.对NOB的检测,只有A/O中试反应器和UASB-A/O小型反应器中存在极少量的NOB,而且NOB种类不同.A/O中试反应器检测出的NOB属于Nitrospira,UASB-A/O小型反应器中的NOB属于Nitrobacteria.2.2dppe条带分析A/O中试反应器、SBR大型中试反应器和UASB-A/O小型反应器3种污泥样品的DGGE分析结果如图3所示,每种污泥样品同时做4个平行样,每种污泥样品DGGE条带的重现性很好.由于PCR引物的目标序列是AOB的功能基因AmoA,因此DGGE凝胶上标记的主要条带应属于AOB.A/O中试反应器和SBR大型中试反应器的DGGE条带模式非常相似,例如条带2和8、3和9、4和10出现在相同的变性梯度位置上.UASB-A/O小型反应器的条带模式明显不同.造成这种差异的主要原因可能是废水水质的不同,A/O和SBR反应器分别处理生活污水和城市污水,水质相近,而UASB-A/O反应器处理城市垃圾渗滤液,从而使不同处理系统的AOB的种类有所不同.3种污泥样品DGGE条带的共同特点是均出现在变性剂浓度30%～50%的范围内,根据文献资料,在该变性剂浓度范围内出现的条带应属于Nitrosomonas-like(Nicolasenetal.,2002).由于DGGE分析结果所能提供的信息是有限的,无法在“种”的水平上确定AOB的种类.如要获得更为准确的分析结果,需要切割DGGE条带,继续进行PCR-DGGE-Cloning-Sequencing分析,从而确定AOB的种类.2.3blast实现序列分析对SBR中试反应器的污泥样品进行PCR-Cloning-sequencing分析.由于PCR引物的目标序列是AOB的功能基因AmoA,因此阳性克隆体的外源基因片段为AmoA基因,测序分析及序列对比分析都是针对AOB的AmoA基因序列.选取8个阳性克隆体(E8、E9、F8、E12、F11、F12、C9、D8)的测序结果进行BLASTsearch的相似性分析,结果如下:E8与Nitrosomonaseuropaea基因序列的相似程度为88%;E9与Nitrosomonassp基因序列的相似程度为82%;F8与Nitrosomonaseuropaea基因序列的相似程度为88%;E12与Nitrosomonaseuropaea基因序列的相似程度为88%;F11与Nitrosomonaseuropaea基因序列的相似程度为88%;F12与Nitrosomonaseuropaea基因序列的相似程度为88%;C9与Nitrosomonassp基因序列的相似程度为84%;D8与Nitrosomonassp.基因序列的相似程度为98%.所有的克隆相似于Nitrosomonas,这与PCR-DGGE分析结果完全一致,其中60%以上的克隆相似于Nitrosomonaseuropaea.采用ClustalW进行目标序列和相关性序列的对比分析并建立系统发育树,如图4所示.3u3000自身缺陷1)采用Fish对SBR大型中试反应器、UASB-A/O小型反应器、A/O中试反应器和SBR小型反应器4种污水短程生物脱氮系统的AOB与NOB进行初步定量分析.在4种短程脱氮系统中,AOB相比于NOB已成为明显的优势菌群,占总菌群的3%～12%.在SBR中试和小试反应器中没有检测出NOB,已实现从系统中淘汰NOB.A/O中试反应器中存在极少量的Nitrospira(<0.2%),而UASB-A/O小型反应器中存在极少量的Nitrobacteria(<0.2%).2)采用PCR-DGGE对SBR大型中试反应器、UASB-A/O小型反应器和A/O中试反应器的污泥样品中的AOB做初步定性分析,DGGE结果显示3种短程脱氮系统中的AOB均以Nitrosomonas-like为主.SBR大型中试反应器中污泥样品的PCR-Cloning-Se