比色法测定饲料还原糖的溶样条件研究

比色法测定饲料还原糖的溶样条件研究

通过比色法测定还原糖是仪器分析的一种方法。其基本原理是3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内,反应液的颜色强度与还原糖的含量呈比例关系,利用分光光度计测定反应液的吸光值就可测得样品的含糖量。比色法是目前使用较为广泛的一种还原糖测定方法,是半微量定糖法。相对于滴定法及高锰酸钾法而言,比色法具有操作简便、快速、杂质干扰较少等特点。试验表明,利用比色法测定小麦样品中还原糖回收率可达94.8%。由于比色法测定还原糖时,需在一定的温度下进行溶样操作,一方面,不同的溶样温度和溶样时间对测定结果有一定的影响;另一方面,饲料中非淀粉多糖酶对饲料中的非淀粉多糖产生催化分解作用,对还原糖测定结果也有一定的影响。研究比色法测定饲料还原糖的溶样条件,消除含酶饲料样品酶制剂对测定结果的影响,可为准确测定含酶饲料还原糖提供参考。1样品的溶解条件1.1通过比色法测定还原糖的基本方法1.1.1主要器材及分析设备(1)试剂:DNS试剂、0.1%葡萄糖标准液、85%乙醇溶液。(2)器材:吸量管(2、10ml)、容量瓶(100ml)、烧杯(100ml)、量筒(100ml)、蒸馏设备、分析天平、离心机、电热恒温水浴锅、UV-4802型分光光度计等。1.1.2葡萄糖标准曲线的绘制配制不同浓度的葡萄糖溶液,并测定其与DNS反应后的光吸收值,以吸光度值为横坐标,葡萄糖浓度为纵坐标绘制出标准曲线,即为葡萄糖标准曲线。1.1.3提取二次的制备准确称取0.2g饲料(过60目,下同),放入100m烧杯内,加入85%乙醇25ml,混匀,在一定恒温水浴中保温一定时间,过滤,滤渣再用85%乙醇提取二次。将滤液合并,蒸去乙醇,加少量水,移入100ml容量瓶中,用水稀释到刻度,备用。1.1.4样品中的糖原测试按葡萄糖标准曲线的制定方法,测得光吸收值。在标准曲线上查出相应的还原糖含量,按下述公式可计算出饲料样品内还原糖的百分含量。1.2试验材料和方法1.2.1试验材料还原糖测定试剂及器材,粉状饲料(小麦,68%;豆粕,25%;菜粕,7%)。1.2.2测试方法设置了40、60、80min三个溶样时间水平,40、50、60℃三个温度水平进行二因素三水平的对比试验。1.3还原糖最佳溶样温度和时间的确定测定结果见表1、表2、表3。对20、40、50、60℃溶样温度进行预测定试验,在30min溶样条件下,发现温度越高,测定值越大。而在超过65℃时,发现试样中出现不明杂质。故设置了40、50、60℃三个温度水平进行测定比较。结果表明50℃溶样温度相对于40℃还原糖测定值有极显著(P<0.01)增加;相对于60℃,测定值没有明显增加(P>0.05)。60℃溶样条件中,样品中还出现少许不明杂质,还原糖测定值的稳定性较差。可见50℃是最佳溶样温度。延长溶样时间,还原糖测定值有一定的递增。通过对40、60、80min三个溶样时间递度进行对比试验,结果表明,溶样时间为60min时,相对于40min,还原糖测定值有极显著增加(P<0.01),80与60min相比,溶出率没有明显增加(P>0.05)。1.4每次1000公里试验结果表明,利用比色法测定饲料中还原糖,最佳溶样温度为50℃,溶样时间为60min。2关于酶诱生法的研究2.1酶的灭活处理据资料表明,50℃左右是多数非淀粉多糖酶的活性温度。也就是说在溶样条件下,非淀粉多糖酶会产生催化降解作用,采用这种测定方法所测定的还原糖含量并不能代表原样还原糖含量。试验证明,饲料含有非淀粉多糖酶时,其还原糖测定值为(9.01±0.20)mg/g,极显著(P<0.01)高于不含酶样品[(4.29±0.02)mg/g]。因此,有必要在测定前对酶进行灭活处理,以消除测定过程酶制剂催化降解的影响。酶的灭活方式有酸碱灭活、干热灭活等。本研究采用干热灭活法。2.2试验材料和方法2.2.1材料表面同1.2.1节,小麦饲粮专用复合酶,酶谱组成为:木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶。2.2.2方法设置105、115、125℃三个加热条件和60、80、100min三个加热时间分别对含酶、不含酶饲料样品进行处理,测定还原糖。2.3干热处理对饲料还原糖含量的影响表4为含酶和不含酶饲料样品还原糖测定值。表5为经不同干热处理条件处理后含酶和不含酶饲料还原糖测定值。结果表明,(1)不经干热处理,含酶饲料样品还原糖测定值高于真值111%(P<0.01)。(2)当饲料中不含有非淀粉多糖酶时,干热处理各条件下,经干热处理与不经干热处理还原糖含量均无显著差异,即干热处理不会引起还原糖的测定值变化(P>0.05)。(3)当处理温度为115℃,时间为100min时,含酶饲料还原糖含量与不含酶不经处理饲料还原糖含量无显著差异(P>0.05),且测定平均值接近。资料表明,饲料中常用的非淀粉多糖酶在95℃时,酶会产生失活。李清峰等研究表明饲用木聚糖酶在95℃时,活性损失率较高,但不能较显著地灭活。预前试验表明,通过95℃处理,含酶饲料样品还原糖测定值均明显高于不加酶饲料(P<0.05),但差异未达到极显著,而温度达125℃时,可能出现糖焦化反应,测定样品中出现不明杂质,吸光值增大,且测定值不稳定。2.4实际含量与测定值的比较含非淀粉多糖酶饲料不经灭活处理测定还原糖含量,其测定值将明显高于实际含量(P<0.01)。样品经115℃处理100min,其测定值与无酶处理样品的还原糖测定值无明显差异(P>0.05)。3不同溶样条件对还原糖溶出率的影响利用比色法测定饲料中还原糖,还原糖的回收率较高,但溶样温度和溶样时间均对测定结果有影响。研究表明,50℃溶样温度还原糖溶出率明显高于40℃(P<0.01),而与60℃没有显著差异(P>0.05)。60min溶样时间还原糖溶出率明显高于40min(P<0.01),而与80min无显著差异(P>0.05)。因此,利用比色法测定饲料还原