基于石墨烯dna纳米金修饰电极的无酶葡萄糖生物传感器

基于石墨烯dna纳米金修饰电极的无酶葡萄糖生物传感器

糖尿病是世界上的一种公共疾病。由于缺乏胰岛素分泌，这种代谢障碍的糖反应为显著水平或低于正常水平的3.9.62m。这种疾病是造成死亡或残疾的重要原因之一。因此,诊断和控制糖尿病需要严格监测患者的血糖水平。糖尿病人占世界人口的5%,每天都有数百万糖尿病人要检测他们的血糖浓度,这使葡萄糖成为一种最常见的传感器检测目标物。目前葡萄糖传感器占了生物传感器市场份额的85%,如此庞大的市场使得葡萄糖传感器成为开发新传感策略的主要模型,巨大的经济前景也激发了科学家们对新型葡萄糖传感器研发的热情,产生了大量的充满创意的葡萄糖传感设计。在诸多类型的葡萄糖传感器中,葡萄糖电化学传感器一直备受关注。基于葡萄糖分子在相关催化活性材料表面的电催化氧化信号对葡萄糖进行定性及定量检测的无酶葡萄糖传感器因其具有制备简单、稳定性好、可重复利用、价格低廉且无需葡萄糖氧化酶的使用等特点,其已成为近年来葡萄糖电化学传感器研究领域的一个热点。Niu等人利用3D多孔纳米镍修饰电极构建了一种具有高灵敏度和高选择性的新型无酶葡萄糖传感器,该葡萄糖传感器具有0.5μM~4.0mM的超宽线性范围和0.07μM的低检测限并可用于血糖的超灵敏监测。Sun等人利用CuO/石墨烯修饰丝网印刷碳电极结合流动注射技术构建了一种具有超高灵敏度及稳定性的新型无酶葡萄糖传感器,该葡萄糖传感器宽线性范围为0.122μM~0.5mM,其检测限可低至34.3nM并可在1h内对葡萄糖进行持续稳定的实时监测。石墨烯是一种由碳原子紧密堆积成单层二维蜂窝状晶格结构的纳米新材料。石墨烯作为一种具有二维结构的新型碳基材料,因其具有更大的比表面积及高电子传导能力、原料易得且价格便宜等优点,已成为继碳纳米管后新一代的理想电极修饰材料。将石墨烯与金属纳米催化材料联合起来构建基于石墨烯-金属纳米复合材料修饰电极的新型无酶葡萄糖传感器将有望进一步提高传感器的各方面性能。本研究结合金纳米颗粒与石墨烯的优点,首先通过电解剥离法制得石墨烯/DNA复合材料,再将纳米金颗粒通过化学还原法固定在石墨烯/DNA复合材料表面,最终制得石墨烯/DNA/纳米金(Gr/DNA/GNPs)复合材料。采用滴涂法将Gr/DNA/GNPs修饰在玻碳电极表面,用于葡萄糖的电化学分析。由于石墨烯表面大量DNA分子的负载作用,该修饰电极要比基于碳纳米管、石墨烯等碳基材料的传统无酶葡萄糖传感器具备更高的纳米金负载量,进而表现出对葡萄糖分子更强的催化氧化能力。该传感器可成功用于人血清样品中葡萄糖浓度的检测,并同时具备更高的灵敏度以及更好选择性和稳定性。1实验部分1.1紫外可见分光光度计及超声波清洗器CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器公司),三电极系统:玻碳电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂丝为对电极;Cary60紫外可见分光光度计(美国安捷伦仪器有限公司);S-4800扫描电子显微镜(日本日立公司);KS-300D超声波清洗器(宁波科生仪器厂)。鲱鱼精DNA钠盐、NaBH4、HAuCl4、葡萄糖均购于上海国药化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯;实验用水为超纯水;所有实验均在室温下进行。1.2gr/dna复合材料的制备在烧杯中分别加入4mg·mL-1DNA溶液1ml与0.1mol·L-1KNO3溶液400mL制成混合溶液,随后将两根高纯碳棒碳棒分别插入上述溶液中构成两电极体系。在超声震荡下,保持电解电位为4.5V,经8h恒电位电解剥离石墨棒,将所得溶液静置1h自然分层后,上层黑色溶液即为Gr/DNA混合溶液,将Gr/DNA混合溶液离心、水洗三次即得Gr/DNA复合材料。将1mg·mL-1Gr/DNA溶液与20mmol·L-1HAuCl4溶液1∶1混合,在超声震荡下逐滴滴加0.1mol·L-1NaBH4溶液200μL,滴加完毕后保持超声震荡30min,将所得Gr/DNA/GNPs溶液离心、水洗三次即得Gr/DNA/GNPs复合材料。1.3超声波清洗器的制备将直径为3mm玻碳电极在抛光布上分别用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光至镜面,然后分别用乙醇和超纯水依次在超声波清洗器中清洗3min,氮气吹干。随后将一定体积制备好的Gr/DNA/GNPs溶液滴涂在处理好的的玻碳电极表面,自然晾干即得Gr/DNA/GNPs修饰电极。2结果与讨论2.1gr/dna/gnps复合材料的构建图1为DNA、Gr/DNA和Gr/DNA/GNPs的紫外-可见光谱。由图可知:DNA在260nm处的吸收峰同样可在Gr/DNA上观察到,说明高纯石墨在含DNA电解液中的电解剥离可使DNA有效地固定在石墨烯之上并形成稳定的Gr/DNA复合材料;而在Gr/DNA/GNPs的紫外可见吸收光谱中,不但可观察到DNA的吸收峰,还可在520nm处观察到GNPs的特征吸收峰,说明GNPs已有效地吸附于Gr/DNA上形成Gr/DNA/GNPs复合材料。图2为Gr/DNA和Gr/DNA/GNPs复合材料的扫描电镜图,图2A中可观察到DNA分子均匀分布于多层石墨烯材料的边缘及表面,图2B中可见大量平均粒径为20nm左右的GNPs在Gr/DNA表面均匀分布且无明显团聚现象。2.2gr/dna/gnps修饰电极的电化学行为图3中曲线a~d分别为裸玻碳电极(0.15mol·L-1NaOH)、裸玻碳电极(0.15mol·L-1NaOH+3.0×10-3mol·L-1葡萄糖)、Gr/DNA/GNPs修饰电极(0.15mol·L-1NaOH)、Gr/DNA/GNPs修饰电极(0.15mol·L-1NaOH+3.0×10-3mol·L-1葡萄糖)的循环伏安曲线。由图可知,Gr/DNA/GNPs修饰电极在0.15mol·L-1NaOH+3.0×10-3mol·L-1葡萄糖的溶液中可明显观察到一个位于-0.403V处的氧化峰,氧化峰电流为-6.553×10-5A,而在其他曲线中均未观察到明显的电化学信号,这主要是由于Gr/DNA复合材料上较多带负电的磷酸骨架结合位点吸附了大量在碱性条件下可直接催化葡萄糖氧化的GNPs。因此选用Gr/DNA/GNPs修饰玻碳电极可在碱性条件下实现对葡萄糖的无酶传感。2.3葡萄糖氧化的峰电流葡萄糖氧化电流的强度不仅与其自身的浓度有关,OH-离子的浓度也是一个十分重要的影响因素。OH-离子的存在能够使葡萄糖分子更容易吸附于电极表面的Gr/DNA/GNPs之上并降低了葡萄糖氧化的活化能。本实验在含有1.0×10-2mol·L-1葡萄糖的浓度分别为0.02、0.05、0.10、0.15、0.20和0.25mol·L-1的NaOH溶液中,用循环伏安法考察了OH-离子的浓度对葡萄糖氧化峰电流的影响。结果如图4所示。由图4可知,随着NaOH浓度即溶液中OH-离子浓度的增加,葡萄糖的氧化峰电流逐渐增大,当OH-离子浓度高于0.15mol·L-1时,峰电流随NaOH浓度增加而降低,因此,本实验以0.15mol·L-1NaOH溶液作为葡萄糖电化学检测的支持电解质。2.4农村葡萄糖的保护循环伏安扫描的过程中电位范围的正确选择与否会直接影响到传感器的检测性能。因此,本实验在含1.0×10-2mol·L-1葡萄糖的0.15mol·L-1NaOH溶液中考察了循环伏安扫描范围对葡萄糖氧化峰电流的影响。如图5所示,实验首先固定最高电位为0V,考察了在-1.2~0V、-1.0~0V、-0.9~0V、-0.8~0V、-0.7~0V五个扫描电位范围内的循环伏安曲线,结果表明扫描最低电位为-1.0V时所得氧化峰电流最大(图5A);随后固定最低电位为-1.0V,考察了-1.0~-0.1V、-1.0~0V、-1.0~0.1V、-1.0~0.2V、-1.0~0.4V五个扫描电位范围内的循环伏安曲线,结果表明扫描最高电位为0V时所得氧化峰电流最大(图5B)。故循环伏安的最终的扫描范围确定为-1.0~0V。2.5gr/dna/gnps修饰量的影响研究了峰电流与Gr/DNA/GNPs修饰量的关系(图6),当Gr/DNA/GNPs修饰量从1μL增加到5μL时,峰电流随之增加,Gr/DNA/GNPs修饰量从5μL逐渐增加到12μL时,峰电流呈现逐渐下降趋势,当这是因为此时电极表面的Gr/DNA/GNPs用量过多,降低了电极的导电性能,阻碍了葡萄糖与电极之间的电子交换所致。故在本实验中,Gr/DNA/GNPs的最佳修饰量选为5μL。2.6gr/dna/gnps修饰电极对葡萄糖的电化学响应图7考察了在最佳实验条件下葡萄糖峰电流大小与其浓度的关系,峰电流与葡萄糖浓度在8.0×10-5~5.0×10-2mol·L-1范围内呈线性关系,其线性回归方程为Ip,a(μΑ)=3.2+14517.4C(mol·L-1),R2=0.999,以三倍信噪比计算该修饰电极对葡萄糖的检出限为1.2×10-5mol·L-1。实验还比较了Gr/DNA/GNPs修饰电极与传统的碳纳米管/纳米金及石墨烯/纳米金修饰电极在相同碱性条件下对葡萄糖的电化学响应情况(数据未列出)。结果表明,碳纳米管/纳米金及石墨烯/纳米金修饰电极对葡萄糖电化学响应的线性范围和检出限均不如Gr/DNA/GNPs理想,这主要是由于石墨烯表面大量DNA分子的负载作用显著提高了对葡萄糖催化氧化其主要作用的纳米金颗粒的负载量,进而使Gr/DNA/GNPs修饰电极表现出对葡萄糖分子更强的催化氧化能力。2.7da和hsa的加入对葡萄糖氧化峰电流的影响在实际样品测定时,一些葡萄糖共存物可能对测定会产生影响。本实验对可能产生干扰的物质如尿酸(UA),抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)及人血清白蛋白(HSA)等进行了干扰测试。据文献报道,健康人血清中的UA与AA的含量分别是0.02×10-3mol·L-1和0.1×10-3mol·L-1,实验在含5.0×10-3mol·L-1葡萄糖的0.15mol·L-1NaOH溶液中分别加入0.2×10-3mol·L-1UA和1.0×10-3mol·L-1AA后,葡萄糖氧化峰电流分别增加了2.9%和3.4%,结果表明UA和AA的加入对葡萄糖的测定几乎不产生影响。这主要是由于修饰电极表面的DNA分子大量带有负电荷的磷酸骨架具有排斥同样为负电的COO-官能团的能力,在碱性条件下,UA和AA均含大量COO-,进而被Gr/DNA/GNPs修饰层所排斥,有效阻止了UA和AA向电极表面扩散,因而可有效地消除这些电活性物质的干扰。实验在含5.0×10-3mol·L-1葡萄糖的0.15mol·L-1NaOH溶液中分别加入相同浓度的DA和HSA后,葡萄糖氧化峰电流分别降低了2.6%和3.3%,结果表明DA和HSA的加入对葡萄糖的测定同样无明显影响。以上实验结果证明Gr/DNA/GNPs修饰电极对葡萄糖的测定具有良好的选择性,可用于人血清样品的检测。2.8修饰电极的稳定性在最佳实验条件下,用同一支电极对含有2.0×10-3mol·L-1葡萄糖的溶液平行测定5次,相对标准偏差(RSD)为3.2%。如每次实验后重新修饰电极,则对含有2.0×10-3mol·L-1葡萄糖的溶液平行测定5次的RSD为3.8%。同一支修饰电极在对浓度为2.0×10-3mol·L-1的葡萄糖溶液分别间隔7、15、30天(其间将修饰电极浸泡在0.15mol·L-1NaOH溶液中,于4℃保存)的测量结果分别比原来的电化学信号降低了3.2%、4.8%和8.6%,说明该修饰电极用于葡萄糖的测定具有良好的重现性和稳定性,其使用寿命至少可达30天以上。2.9修饰电极的检测分别取1.0mL血清样品(商丘市中心医院提供),用0.15mol·L-1的NaOH溶液稀释至10.0mL,按上述方法测定,血清的样品测得值即为实验测得值的10倍;同时为了进一步考察该修饰电极的实用性,对相同样品采用常用市售血糖检测仪进行了测试比较。实验结果如表1所示,连续5次测定,3份样品的分析结果RSD均小于3%,样品加标回收率在9