白藜芦醇的压缩法纯化研究

白藜芦醇的压缩法纯化研究

近年来的研究表明，白银醇是一种含有特定激素的非黄酮类多酚类化合物，具有重要的生理功能。它可以抑制癌细胞，抑制心血管疾病，抵抗抗菌，阻力和抗衰竭。它被称为紫杉醇，是紫杉醇之后的一种新的绿色抗癌药物。引起了许多专家和科学家的注意，并进行了大量研究。硅胶柱层析法是目前广泛使用的一种分离纯化技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其他色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学以及其他领域内有效的分离分析工具之一。近年来,也有学者将其应用于菝葜、剑叶龙血树、毛脉蓼等植物中白藜芦醇的分离。还有苏文强等采用中压柱层析法对虎杖中白藜芦醇粗提液进行纯化,然后经重结晶后,可使白藜芦醇的纯度达到99%以上。但是还未看到有花生根中白藜芦醇的硅胶柱层析分离纯化的相关文献报道,而且也没有文献系统地进行硅胶柱纯化白黎芦醇的工艺研究,因此本文采用硅胶柱层析法对花生根中白藜芦醇的大孔树脂纯化物进一步分离纯化进行了研究,确定了硅胶柱层析纯化白藜芦醇的各项工艺条件。1材料和方法1.1-2-甲基苯基氨基羧酸白藜芦醇标准品(resveratrol>99%):美国Sigma公司;200~300目柱层析用硅胶、硅胶G薄层层析用硅胶:青岛海洋化工厂;羧甲基纤维素钠(AR)、氯仿(AR)、甲醇(GR)、丙酮(AR)、石油醚(AR)、乙酸乙酯(AR)、甲酸(AR)、乙腈(AR):湖南师大化学试剂厂。薄层层析显色器;薄层层析展开槽(20cm×20cm×10cm);薄层层析薄层板(20cm×10cm);毛细管点样器(0.5mm);层析柱(1.6cm×30cm);高效液相分析仪(P680泵,UVD170监测器):美国戴安公司;微孔滤膜(0.22μm)。1.2实验方法1.2.1超声波提取工艺使用冷冻干燥法对花生根样品进行干燥处理(时间12h)。用中药粉碎机对干燥样品进行粉碎,过40目筛。以乙醇浓度73%,超声功率290W,萃取时间5.6min,液料比17.5∶1为萃取条件,进行超声波提取。将提取液经旋转蒸发浓缩到浓度为0.5mg/mL后,经大孔树脂柱层析纯化,得到白藜芦醇乙醇溶液,经真空旋转蒸发得到膏状物,然后经真空冷冻干燥得到白藜芦醇粗品,备用。1.2.2标准曲线的绘制(1)色谱条件:色谱柱HypercloneC18柱(250mm×4.60mm×5μm);流动相(水∶乙腈)=70∶30;流速0.6mL/min;紫外检测波长305nm;进样量20μL。(2)标准溶液的配置:准确称取白藜芦醇标准品5.70mg,用甲醇定容于25mL容量瓶中,摇匀。使用移液枪分别移取0.5、1、2、4、8mL于10mL容量瓶中,配制成白藜芦醇标准溶液,然后分别进行HPLC检测。对配制好的白藜芦醇标准品溶液进行HPLC检测,得到在11.286、22.572、45.144、90.288、180.576μg/mL浓度下HPLC的峰面积。以标样浓度为x轴,得到的峰面积为y轴,进行线性回归得到白藜芦醇的HPLC标准曲线(图1)以及白藜芦醇的标准品液相色谱(图5)。标准曲线方程:式中:y为白藜芦纯峰面积。x为白藜芦醇浓度,线形范围为11.26~100.576μg/mL。(3)样品处理:硅胶层析柱纯化得到的白藜芦醇洗脱液使用氮吹仪吹干有机溶剂,然后溶解于甲醇中,再经0.22μm滤膜过滤后进行HPLC色谱分析。1.2.3样品点样、展开线(1)铺板:先配制0.5%的羧甲基纤维素钠溶液。以1∶3的比例溶解薄层层析用硅胶6g于研钵中。研磨匀浆无固体颗粒及气泡,然后倾倒在玻璃板上,抖动玻璃板使之平整。然后在室温下晾干,使用前在105~110℃烘焙0.5~1h即可。(2)点样:固体样品通常溶解在甲醇中配成1%~5%的溶液,用内径为0.5mm的平口毛细管吸取样品溶液点样。点样前可用铅笔在距薄层板一端约1cm处轻轻地画一条水平横线作为“起始线”。然后将样品溶液小心地点在“起始线”上。(3)展开:把点好样的薄层板放进展开槽中展开。当展开剂前沿升至距薄层板上端约1cm处时,取出薄层板并立即标记出前沿位置。(4)现色:1%铁氰化钾水溶液-2%的三氯化铁水溶液使用前等体积混合,使用显色器喷在展开的薄层板上。1.2.4粗树林表面白馈柱的纯化(1)硅胶的活化:将硅胶置于烘箱中,在105~110℃最佳活化条件下,保持30min,进行活化处理,然后即可装柱。(2)装柱:本实验采用湿法装柱、湿法上样。选取合适的玻璃柱,称取适量的硅胶(200~30目)放入烧杯中,然后加入石油醚或氯仿,使液面高出硅胶面2cm,然后放入真空干燥箱中抽真空约1h,抽去其中空气。然后准备一支较长的玻璃棒,在装柱时边倒硅胶石油醚混合液边用玻璃棒搅拌使硅胶均匀沉降,并且使硅胶一次加完。全部吸附剂加完后,在吸附剂沉积面上盖上一张直径与柱内径相当的滤纸片。(3)上样:将大孔树脂纯化后的白藜芦醇粗粉溶于尽可能少的甲醇中,然后打开柱下活塞小心放出柱中液体至液面下降到滤纸片处,关闭活塞,将甲醇溶液沿着柱内壁缓缓加入。(4)洗脱:样品加入后即加入大量洗脱溶剂洗脱。事先准备30个收集瓶,依次编出号码,各接收相同体积的流出液,并各自在薄层板上点样展开,然后在薄层板上显色。1.2.5展开剂的选择(1)薄层层析法选择洗脱溶剂:在活化好的薄层板上点样,分别是白藜芦醇标准品和大孔树脂纯化后的样品,然后放入展开槽中展开。分别选择展开剂为氯仿:甲醇=4:1~10:1进行展开,然后记录展开后的薄层板的特征并计算各个点样点的值。式中:Rf为比移值;a为原点到斑点中心的距离;(2)柱层析选择:使用经薄层层析确定的洗脱溶剂比例范围进行洗脱,然后用50mL三角瓶分段收集洗脱液,各个收集瓶中的洗脱液用薄层板进行检测,寻找白藜芦醇所在的洗脱瓶,确定分离效果最好的洗脱剂比例。1.2.6大孔树脂的hplc纯度检测准确称取200~300目100g硅胶进行装柱,分别称取大孔树脂纯化后的粉末5.00、3.33、2.50、2.00、1.67、1.25g,用适量的甲醇溶解,然后上样洗脱,收集得到的目标成分进行HPLC纯度检测。1.2.7纯度试验，纯产品的纯度准确称取5.00mg硅胶柱层析纯化后的结晶产物,定溶于100mL的容量瓶中,进行HPLC检测。2结果与分析2.1反渗透膜柱的下一步实验(1)由薄层层析法实验得到表1,薄层层析的Rf值处于0.2~0.4之间的展开剂比例适用于硅胶柱层析,而且视觉观察也明显证明其比例能够使目标成分与其他杂质分离,因此确定氯仿与甲醇的比例为9∶1、10∶1,进行下一步实验。(2)柱层析法选择如图2所示,在洗脱溶剂为氯仿和甲醇的比例为9∶1时,可以把白藜芦醇和其他杂质分离,能够作为洗脱溶剂应用于硅胶柱层析,另外由于增大氯仿比例时,同时也会增加淋洗的时间以及洗脱的溶剂量,因此选择氯仿与甲醇比例为9∶1为最佳洗脱溶剂。图3为柱层析纯化后的目标成分与白藜芦醇标准品的薄层层析展开图,由此可以确定其目标成分与标准品是同一物质,即反式白藜芦醇。2.2进料量对白垩系黄粱醇上样的影响使用上述讨论确定的洗脱溶剂,即氯仿∶甲醇=9∶1时,不同上样量的条件下洗脱得到的白藜芦醇样品经HPLC检测其纯度得到图4。随着进料量的增加,层析吸附平衡从等温线的线性范围向非线性范围移动当进料量很大时,层析柱吸附平衡往往处在非线性范围。当填料量与上样量之比为50∶1时白藜芦醇的纯度不再增加,可以确定其上样量为2.0g,其纯度可以超过99%以上,且不浪费硅胶填料。而且由图5、图6可以看出,经硅胶柱层析纯化后的针状结晶产物,就是实验所要求得到的目标产物反式白藜芦醇。3硅胶柱层析和流动相的选择(1)经大孔树脂纯化后的样品粉末,通过一次硅胶柱层析,得到的白藜芦醇针状结晶,其纯度可以超过99%。(2)通过薄层层析和硅胶柱层析对洗脱溶剂的研究发现,在氯仿与甲醇之比为9∶1时,对目标产物即可达到很好的分离。(3)在不同的吸附剂与样品量之比进行的实验条件下,通过硅胶柱层析得到的白藜芦醇纯化产物,然后使用HPLC检测其纯度,发现在吸附剂与样品量之比50∶1时白藜芦醇的纯度即可以达到最高。硅胶是氢键型固定相,其表面的终端是硅醇或硅氧烷。硅氧烷不具吸附性,硅醇基能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键,具有吸附性,因此硅胶对复杂有机化合物地分离具有很高地效率。另外硅胶具有其他较多的优点,如线性容量较高,机械