青蒿琥酯对hela、siha细胞放射增敏作用的研究

青蒿琥酯对hela、siha细胞放射增敏作用的研究

近年来，国内外科学家对中药的治疗做出了深入的研究和开发。1973年，中国科学家从中药科黄科植物中分离出具有活性的单胞菌黄酮素。青蒿琥酯（Artesunate,Art）是青蒿素的众多衍生物之一，分子式为C19H28O8，呈无色结晶或白色结晶性粉末，无臭，几乎无味。研究发现，青蒿素类药物作为抗肿瘤药，其对肝癌、胰腺癌、肺癌等具有明显的抑制作用。同时鉴于青蒿素及其衍生物内的过氧化桥分子结构及其众多药理作用，近来对其放射增敏作用机理进行了充分研究。但是青蒿琥酯作为放射增敏药物，对人宫颈癌细胞作用3研究还未见报道。本实验将通过细胞辐射损伤实验，分析研究青蒿琥酯对人宫颈癌细胞的辐射增敏作用。1实验材料和方法1.1青蒿背景酯、胞松素b、cyt-b染色剂MTT购于上海生工公司；秋水仙素（Colchicine）、胞松素B(CytochatasinB,Cyt-B）、青蒿琥酯、Giemsa染色剂均购于美国Sigma公司；显微镜为日本Olympus公司BX51型。1.2实验方法1.2.1上海细胞库人宫颈癌HeLa、Siha细胞株，购于中国科学院上海细胞库。接种细胞在含10%小牛血清DMEM培养基细胞瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养，单层贴壁生长。1.2.2吸收剂量测定室温条件，60Coγ射线，剂量率0.57Gy/min，各组吸收剂量分别为0、2、4和6Gy。试验在苏州大学放射医学与公共卫生学院辐照中心进行。1.2.3药物的制备青蒿琥酯粉末由5%NaHCO3溶解为5g/L的储备液，-20℃保存备用，实验前用DMEM培养液将其稀释至实验所需浓度。1.2.4青蒿违全酶活性检测青蒿底物a值将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化，细胞计数后，培养液稀释至浓度为4×104/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μL，培养24h后，加入配制的青蒿琥酯溶液使终浓度分别为0、1、2、4、8、10、20和40μg/mL，各浓度点设置5个平行样。继续培养24h后，换培养基，每孔加入5mg/mLMTT20μL，孵育4h，弃上清，每孔加入DMSO100μL，振动5min后，酶标仪（背景波长570nm、参考波长630nm）测吸光度（A）值。计算细胞抑制率：细胞抑制率（%）=（1-各药物浓度组平均A值/对照组平均A值）×100%。1.2.5体外细胞后细胞的制备取对数生长期的细胞，以3×105/mL浓度接种于60mm培养皿中，每皿均为2mL细胞悬液，待细胞贴壁后，药物处理组加入青蒿琥酯溶液，每组均准备四个剂量点样，每个剂量点准备3个样，培养24h后进行照射。照后细胞立即更换培养基并加入0.001%秋水仙素20µL，继续培养10h。用0.25%胰酶消化并收获细胞移入试管中，经2000r/min离心10min，弃上层培养基，加入2mL37℃预温的0.075mol/LKCl低渗、新鲜固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定处理、冰玻片常规滴片、Giemsa染色，制成染色体片。显微镜下选择染色体分散度良好的中期分裂相300个细胞，计数染色体型畸变：双着丝粒体（dic）+着丝粒环（r）、染色体断片。1.2.6显微染色，观察组微核片的制备照射前及照射中处理与常规染色体畸变法相同，照后细胞立即更换培养基并加入Cyt-B（终浓度为4mg/L），继续培养24h。用0.25%胰蛋白酶消化并收获细胞移入试管中，经1,000r/min离心10min，弃上层培养基，加入2mL37℃预温的0.075mol/LKCl低渗处理，新鲜固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定处理、常规滴片、Giemsa染色，制备完整细胞微核片。显微镜下计数。计数标准(1)双核细胞：胞体较大，胞核为2个，此系经过一次分裂并被Cyt-B阻滞所致。染色质较细致、疏松，核仁多清晰可见，胞浆丰富。(2)微核鉴别标准：微核必须位于双核细胞质中，与主核完全分开，如有重叠或相切，必须看到各自完整的核膜；微核呈圆形或椭圆形，直径小于主核的1/3；无折光性；着色与主核相同或略浅。(3)分析细胞：油镜下（10×100）计数，其中所含微核的细胞比率、微核的比率分别为微核细胞率（MNCF）、微核率（MNF），以千分率（‰）表示。1.3染色体畸变试验实验结果采用SPSS17.0统计软件分析，数据均以均数±标准差（x±s）表示，对照组与处理组间比较采用t检验，各剂量组间差异采用One-wayANOVA分析，染色体畸变率、MNCF、MNF与剂量间的关系采用直线回归与相关分析。p<0.05为差异有统计学意义。2结果和分析2.1青蒿表现对hela、siha细胞的辐射损伤作用从表1中可见，青蒿琥酯作用于HeLa及Siha细胞24h后，其对细胞的抑制率随药物浓度的增加而增加（p<0.01）。在药物浓度分别为2μg/mL、4μg/mL时，青蒿琥酯对HeLa、Siha细胞的抑制作用较小，差异无统计学意义（p>0.05），故为减小药物对细胞的毒性作用及最大程度的增加药物的放射增敏效果，并使以下试验中药物对两种细胞株的影响大致相同，确定HeLa、Siha细胞的辐射损伤试验将分别采用药物浓度2μg/mL、4μg/mL。2.2辐照对hela细胞回归方程的影响HeLa、Siha细胞经60Coγ射线单纯照射组、药物处理联合辐照组，双着丝粒体（dic）+着丝粒环（r）、染色体断片结果见表2和表3，并发现HeLa、Siha细胞中染色体数目均为为非整倍体。从表2和表3中可见，同组HeLa或Siha细胞中的dic+r及染色体断片率均随着受照剂量的增加而增大。HeLa细胞在2、4和6Gy剂量下，与相同剂量辐照的单纯照射组dic+r及染色体断片率均低于药物处理组（p<0.05），而Siha细胞药物处理组与单纯照射组的dic+r及染色体断片率均无明显统计学差异（p>0.05）。在未予辐照的情况下，加药处理组与单纯照射组结果差异无统计学意义（p>0.05）。从表2和表3数据相关分析表明，HeLa或Siha细胞单纯照射组和药物处理组的dic+r及染色体断片率均与辐照剂量成正相关。应用SPSS软件回归分析拟合二次回归方程：HeLa细胞二次回归方程单纯照射组dic+r率：药物处理组dic+r率：单纯照射组染色体断片率：药物处理组染色体断片率：Siha细胞二次回归方程药物处理组dic+r率：单纯照射组染色体断片率：药物处理组染色体断片率：式中，Y为染色体畸变率（%），D为受照剂量（Gy）。从以上回归方程可看出dic+r率的线性方程为直线平方方程，而染色体断片率为直线方程，拟合度均良好，回归系数有高度的统计意义（p<0.01）。2.3辐照对mnpf和mnf的影响HeLa、Siha细胞经60Coγ射线辐照单纯照射组、药物处理组微核细胞率、微核率计数结果见表4和表5。从表4和表5中可见，HeLa或Siha细胞的MNCF与MNF均随照射剂量增加而增加（p<0.01）。HeLa细胞在2、4和6Gy剂量下，与相同剂量辐照的单纯照射组与药物处理组的MNCF存在明显差别，具有统计学意义（p<0.05），另一指标MNF的差别亦有统计学意义（p<0.05）；而Siha细胞药物处理组与单纯照射组的MNCF或MNF均无明显统计学差异（p>0.05）。HeLa或Siha细胞在未予辐照的情况下，加药处理组与单纯照射组结果差异无统计学意义（p>0.05）。从表4和表5数据相关分析表明，HeLa或Siha细胞单纯照射组和药物处理组的MNCF与MNF均与辐照剂量成正相关。应用SPSS软件回归分析拟合二次回归方程：HeLa细胞二次回归方程单纯照射组微核细胞率：药物处理组微核细胞率：单纯照射组微核率：药物处理组微核率：Siha细胞二次回归方程单纯照射组微核细胞率：药物处理组微核细胞率：单纯照射组微核率：药物处理组微核率：式中，Y为微核率或微核细胞率(‰)，D为照射剂量(Gy)。线性方程拟合度均良好，回归系数有高度的统计意义（p<0.01）。3青蒿素辐射增敏机制我们在选择了对实验细胞毒性较小的药物浓度这个前提下，实验结果显示：相同辐照剂量下，Hela细胞经青蒿琥酯联合辐照处理后，染色体双着丝粒体+环、染色体断片率、微核细胞率、微核率均较单纯照射组明显增高，而Siha细胞相应的指标并无统计学差异。结果表明，青蒿琥酯对Hela细胞具有放射增敏性，对Siha细胞无放射增敏性。对于青蒿素类药物的放射增敏机制国内外进行了广泛的研究，其机制较为复杂，有着众多激酶参与，并与周期调控有关。文献报道了二氢青蒿素的辐射增敏机制与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）表达降低及转铁蛋白量增加有关。我们课题组前期对青蒿素类药物的辐射增敏机制进行了深入探讨，发现青蒿素能通过降低细胞周期蛋白wee1的表达量，增高cyclinB1的表达量，减弱p53突变基因细胞辐照后诱导的G2/M期阻滞效应，使细胞的辐射损伤更为明显，并且青蒿素能明显提高辐照后细胞的微核率。细胞从G2期进入M期的主要调节因素是Cdc2/CyclinB蛋白复合体。Cdc2一方面与CyclinB1相结合发挥功能；另一方面也受磷酸化影响被抑制活性。Thr-161磷酸化是Cdc2激酶活性所需的，而Thr-14和Tyr-15磷酸化则抑制Cdc2激酶活性。Weel则是控制Cdc2的Tyr-15磷酸化的主要激酶。Hela是p53基因突变细胞，其受到辐射损伤后只能通过G2期阻滞来进