植物蛋白质组学研究进展

植物蛋白质组学研究进展

科学家们已经证明，核酸、蛋白质和其他高生物活性物质是控制生命活动的源泉。在这里，核酸控制着所有生命，而蛋白质是能够控制人类生活活动的必要条件的执行者。人类生命的整体功能最终体现在其组织的蛋白质上。现在，科学研究的重点已经变成了基因功能的研究。此外，我们必须了解整个重组过程及其整个过程中物质产品的结构、功能、机制和互动深度，了解生命活动的全貌，系统整合相关科学合理的所有知识。以这种强调系统和全球思想的推动，提出了一个新的蛋白质体系理论。蛋白质是生物身体在不同环境、不同基因、不同生长发育阶段、不同细胞器官、不同生理条件和病理学条件下所有功能的忠诚直接执行者。因此，蛋白质组的这项研究促进了对生物所有生命活动的全球研究。蛋白质组的研究及其应用促进了计算机科学的新领域、新领域和新领域。由于植物生长发育规律和所处环境的特殊性及复杂性加大了科学研究的难度,使植物生命活动的研究总是落后于人类和其它动物.但是分子生物学的蓬勃发展对植物生命活动的研究提供了有效而可靠的手段.为了全面准确地了解和揭示植物生命活动的规律,对其在分子水平上的研究工作应将基因组研究和蛋白质组研究并列开展.本文中主要综述了蛋白质组学的研究方法及其在植物研究中的应用.1蛋白质组学研究对象的确定生物种属、器官、组织、细胞、亚细胞以及生长发育时期的特异性都是多个蛋白质的相互作用的结果.生物某一遗传性状的表现涉及到多个基因的表达、多个蛋白质的参与,而且这些蛋白质在时空上的特异性和分子间的相互作用是非常复杂的生命活动过程.要查清生物生长发育、抗逆性、优良性状的表现,生物个体和生物性状的遗传背景,遗传信息的传递过程和生物体大分子间的相互作用的机理,必须用“系统”的、“整体”的思维和研究方法来研究不同状态下的所有蛋白质的变化规律和功能表现.这是蛋白质组学的中心思想.蛋白质组是指某一物种、个体、器官、组织、乃至体液在精确控制其环境条件之下,特定时空的全部蛋白质表达图谱.而蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象,在整体水平上研究蛋白质的组成和调控活动规律的一门新兴学科.蛋白质对生命活动的直接作用比基因复杂得多.对于某一种生物或有机体来说,基因组是唯一的,而蛋白质组随细胞的种类、功能、生理状态、环境条件和病理状态而不断变化,因此仅仅从基因的角度来研究是不够的.从基因和蛋白质的对应关系来看,蛋白质的数量远远多于基因数量,一个基因可表达的蛋白质的数目细菌可能为1.2~1.3,酵母则为3,而人可达10.而且mRNA水平不能完全反映蛋白质表达水平,基因表达水平与蛋白质之间的相关性通常低于0.5.另外,蛋白质的合成、降解、修饰加工、转运定位、蛋白质之间的互作等与细胞自身的生理生化过程和生物学功能密切联系.因此,一个生命体蛋白质的整体水平具有动态性、可变性、时空性和可调节性.2蛋白质的提取蛋白质组样品制备的一般过程是:对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活和还原,断开蛋白质之间的连接键,提取全部蛋白质,除去非蛋白质部分.目前,蛋白质样品的制备还可以用激光捕获显微切割技术(lasercapturemicrodissection,LCM).LCM技术实际上是一种原位技术,可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型,取出的细胞用于蛋白质样品的制备,结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线,可以对蛋白质的表达进行原位的高通量的研究.样品提取后,可进行蛋白质的分离和鉴定.2.1蛋白质分离技术2.1.1-de电泳双向凝胶电泳(two-dimensionalgeleldctropgoresis,2-DE)是最常用的蛋白质分离技术.该技术应用两个不同分离原理为依据进行分离,即利用蛋白质分子的等电点(PI)和相对分子量的不同进行分离.第一向电泳是蛋白质的等电聚焦,根据蛋白质等电点差异进行分离,该分离技术采用固定pH梯度技术(IPG)可以实现等电点只差0.01pH单位的蛋白质的分离;第二向电泳是利用蛋白质相对分子量差异进行分离,可分离相对分子量在100×103~150×103的蛋白质.2-DE根据等电聚焦条件和方式的不同可分为三种:(1)平衡pH梯度电泳(ISO-DALT),在聚丙烯酰胺凝胶中进行,采用载体两性电解质pH梯度等电聚焦;(2)非平衡pH梯度电泳(nonequilibriumpHgradientselectrophoresis,NEPHGE),常用于分离碱性蛋白质,pH值为7~11.5;(3)IPG-DALT,是丙烯酰胺和不同的pH值的固定化电解质共聚所形成的具有pH梯度的IPG胶.双向凝胶电泳的蛋白质样品需要进行变性处理,2-DE蛋白质分辨率可以达到ng级.2.1.2层析分离由于高效液相色谱技术具有较高的灵敏度,蛋白质样品不需要变性处理可直接分离,可上样、收集、分析进行自动化,适用于分离简单样品的蛋白质组研究中.周俊宜等采用层析法分离了人类端粒酶复合体的蛋白质组,并对其蛋白质组组份进行了分析,他们成功地分离了人类端粒酶复合体的4种蛋白质亚基成分,其蛋白质相对分子量分别为220×103、212×103、116×103和43×103.2.2pvdf膜下基因染色蛋白质被分离后常用银染、考马斯亮蓝染色、无机盐负性染色、荧光染色、免疫抗体结合染色和放射性标记等进行显色,也可用丽春红S、氨基黑、印度墨、S35硫脲银、胶态金、咪唑锌等试剂进行染色或检测,其中银染方法较灵敏,分辨率可达ng级.考马斯亮蓝染色法可在胶上或膜上蛋白质进行点染,具有操作方便、重复性好等优点.银染和考马斯亮蓝染色均对质谱测定有干扰,必须先脱银或脱色.胶上蛋白质显色后根据被染色的蛋白质点进行直接切割或转到PVDF膜上进行切割.切割后的蛋白质通常用酸水解、放射性标记法或蛋白质酶水解法等方法切成小的肽断后进行鉴定.2.2.1质谱分离和质谱处理生物质谱技术(bio-massspectrometry)具高灵敏度和准确度,且容易实现自动化.其原理是先使样品分子离子化,然后根据不同离子之间的质荷比的差异来分离并确定相对分子质量.生物质谱技术按照样品离子化的方式分为电喷雾离子化质谱(electrosprayionizationmassspectrometry,ESI-MS)和基质辅助的激光解吸质谱(matrixassistedlaserdesorptionionizationmassspectrometry,MALDI-MS).前者主要靠强电场使样品分子连续离子化,测定相对分子量数万的蛋白质准确度可达万分之一.此技术液相进样,它可以与高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)等技术相连,双向凝胶电泳分离的蛋白质点,经酶切后生成的肽混合物可直接导入ESI串联质谱分析仪中.后者利用激光脉冲辐射分散在样品中,使其解析形成离子.它与TOF-MS联用.该技术精确度、灵敏度和效率均较高,分析时间短.2.2.2双标准抗体的原理蛋白芯片技术(proteinchip)的出现给蛋白组学研究带来新思路.蛋白质芯片是高通量、微型化、集成化和自动化的蛋白质分析技术.蛋白组学研究中一个主要的内容就是要研究在不同生理状态或病理状态下蛋白水平的量变,微型化、集成化、高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具,它也是蛋白芯片中发展最快的芯片,而且在技术上已经日益成熟.第一张商品化的抗体芯片是由美国BDClontech公司推出的.这是一张用于研究的抗体芯片,芯片上排列了378种已知蛋白的单抗(AbMicroarray380,目录号K1847-1),这些单抗对应的蛋白都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白,涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等广泛的领域.目前蛋白质芯片主要分两种:(1)在固相支持物表面高密度排列的探针蛋白质点阵,可特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析;(2)微型化的凝胶电泳,在电场作用下,样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来,经喷雾直接进入质谱仪中进行检测,以确定样品中的蛋白质的分子量及种类.芯片上的探针是具有生物活性的蛋白质,如抗体、抗原、受体、酶等,用于生物学标志的检测,如疾病诊断和疗效判定.蛋白质芯片技术由于是在体外条件下进行操作,因此在蛋白质相互作用研究中必将成为理想的工具.2.2.3生物传感芯片质谱技术目前生物传感器芯片质谱技术(biosensorchip-basedmassspectrometry)是进行蛋白质组成成分鉴定的支撑技术,但是它在蛋白质相互作用分析及结构与功能的关系分析方面显得无能为力,而生物传感芯片质谱技术在蛋白质研究中有其独到作用.生物传感芯片质谱技术是生物分子相互作用分析技术(Biomolecularinteractionanalysis,BIA)和基质辅助的激光解吸质谱技术的有机结合.Nelson等首次将BIA和MALDI-TOF-MS结合在一起组成生物传感芯片质谱来研究兔的多克隆抗人肌红蛋白IgG(人肌红蛋白)与单克隆抗人肌红蛋白之间的亲和性相互作用系统,该系统可对芯片上化合物间的相互作用进行实时监测,其监测水平可达飞摩尔(20fmole)数量级.2.2.4转录活性剂基因a和b共价作用后的基因结构域分析酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用的工具,其原理是:真核细胞的转录调控由两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(BindingDomain,BD)和转录活化结构域(ActiveDomain,AD)组成.分别与BD和AD融合形成的两个融合蛋白可以激活转录.将外源蛋白A和B分别插入到BD和AD基因附近,当编码两种结构域的基因在细胞核内同时表达时,蛋白A和B之间若存在非共价作用,就会使AD与BD两结构域的上游活化序列(UpsteamActivationSequence,UAS)相互接近,进而激活转录过程,使报告基因得到表达.2.2.5烷基因信息的检测噬菌体展示技术(PhageDisplayTechniques,PDT)是一种新的蛋白质相互作用研究技术.一般使用丝状噬菌体,它是将外源基因插入到噬菌体外壳蛋白pIII或pVIII的基因中,并使其与编码噬菌体外壳蛋白编码的多肽或蛋白质与外壳蛋白以融合蛋白(fusionprotein)形式展示在噬菌体表面,被展示的多肽蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性.其优点为:建立了基因型(genotype)和表现型(phenotype)之间的直接物理联系,从而使筛选简便高效.将外源蛋白或多肽表达于噬菌体表面,就可根据其性质利用它与其他生物或非生物物质的亲和性对含目的基因的噬菌体进行筛选,并利用这些噬菌体再感染大肠杆菌,扩增.还可从重组噬菌体DNA中切出外源基因再克隆到其它宿主细胞中,经表达以获得大量外源基因产物.由于其简化了抗体库构建及单克隆抗体的筛选过程,很快应用于人工抗体制备方面.cDNA文库的展示系统也有很好的应用前景.3功能模式的应用目前,蛋白质组学的研究热点主要集中在原核生物及一些简单的真核生物,尤其是基因序列被完全搞清楚或大部分已知的生物上,而在植物中的应用却鲜见报道.蛋白质组功能模式的研究还刚刚起步,但是已在植物研究中显示出了广阔的应用前景.建立植物的蛋白质组数据库及确定各蛋白质的作用模式、功能机理、调节控制及蛋白质之间的相互作用对于研究植物的生长发育机理,病虫害防治及遗传育种都具有重要的理论意义和实用价值.3.1对植物生理和功能的研究蛋白质组学将促使植物的生长发育、信息传递、衰老死亡、新陈代谢途径和代谢调控机理等基本生命活动规律的研究产生新的突破.对植物在不同的生理状态、不同环境、不同生长发育阶段、不同亚细胞分室的蛋白质组的成分和数量等进行比较以及功能研究,可为生理代谢机理和调控机制提供重要的理论依据.Setsuko等人通过比较光照和暗室条件下的水稻中蛋白质差异,鉴定了与光合作用有关的蛋白质,有助于了解光合作用的机理.3.2盐胁迫对植物抗逆性的影响自然界中的植物总是处于微生物的包围之中,其中绝大多数植物不被感染,表现出抗病虫性,并在体内产生病原相关蛋白质(pathogenesis-relaedproteins,PR蛋白).另外,在世界范围内,干旱、盐碱地、水涝、高温、寒冷等环境恶劣地区也有广泛的植物分布.从生态学的角度来看,分布在这些严酷环境中的植物具备不同程度的适应性,也产生某种或几种蛋白质来抵抗环境胁迫.植物受到盐逆境胁迫时也会合成特异的蛋白质以提高抗性.Singh等对筛选出来的烟草NaCl适应型细胞系蛋白质组进行了分析,发现NaCl适应型细胞系中存在相对分子量为58×103、37×103、35×103、34×103、26×103、21×103、19.5×103和18.5×103的耐盐蛋白质,其中26×103蛋白质大量积累.Ramagopal研究生长在含NaCl培养基上的玉米愈伤组织蛋白质组组份,发现合成新的相对分子量为26.2×103、28.5×103和74×103的耐盐蛋白.马焕成研究表明,盐胁迫7天后,胡杨根组织蛋白质组谱带产生了3条新的蛋白谱带.通过对抗病植物种和感病植物种的蛋白质组或正常和不正常条件下的同种植物、同一种条件下的不同植物的蛋白质组数据入手,比较研究植物的抗逆性,即蛋白质种类和数量的改变,蛋白质之间的相互作用与抗逆性之间的关系等,从而在寻找或确