酵母双杂交系统中蛋白质转录激活的研究

酵母双杂交系统中蛋白质转录激活的研究

1分子身份证编码基因随着现代医学的发展，各种生物技术的研究工具层出不穷。在这种条件下，建立了真空双交系统。Field和Song首先提出酵母双杂交系统,这是一种直接于酵母细胞内检测蛋白质之间互相作用的新方法,可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因。该技术以其简便、灵敏、高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点得到广泛应用。它们证明了任何可以互相配对的蛋白质都可以通过结合将互相分开的BD和AD拉近,并从而形成一个转录激活复合物。在一个典型的酵母双杂交系统中,通常包括2个融合蛋白,一个由已知的蛋白X与BD组成,另一个由未知蛋白Y与AD组成,前者通常被称为诱饵(bait),而后者通常被称为猎物(prey)。此外,还包括一个人工构建的,具有BD结合位点以及报告基因(reportergene)的质粒。如果诱饵和猎物能够在宿主细胞内同时表达,那么由于两者的互相作用,BD和AD形成转录激活复合物,从而激活报告基因的表达。2转录活性成分酵母双杂交系统最初是根据真核转录调控的特点建立的。真核生长转录因子含有两个相对独立的功能区域(DNAbindingdomain)和转录激活结构域(activationdomain,AD)。DNA-BD能够识别效应基因的上游激活序(UpstreamActivatingSequence,UAS),并与之结合。DNA-AD则是通过同转机(TranscriptionMachinery)中的其他成分之间的结合作用,以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD可以人为的分离,分离的DNA-BD和AD单独分别作用,并不能激活转录反应,但当两者在空间上较为接近时,则呈现完整的转录因子的转录激活活性,将DNA-BD序列与一已知的蛋白质X(常成为诱饵)的基因结合,构建出BD-X融合表达载体,将AD序列与拟研究的另蛋白Y-靶蛋白(prey)的基因结合,构建出AD-Y表达载体。将这2个表达载体共转化至酵母细胞内表达,此种酵母菌株既含有特定报告基因,并且已是去掉相应转录因子的编码基因,因此本身无报告基因的转录活性。如果蛋白质X和Y可以互相作用,则即导致BD和AD在空间上的接近,从而激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达,反之,BD与AD就不能结合,报告基因也不能被启动表达(图1)。3融合蛋白检测的作用机制酵母双杂交系统具有以下优点:①敏感性。主要是由于系统能使融合蛋白过量表达。激活结构域和结合结构域形成转录起始复合物,之后又与启动子结合,此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定。检测结果是基因表达产物的积累效应,如酵母的表形,因而可检测存在于蛋白之间微弱或暂时的互相作用。②真实性。检测在活细胞内进行,作用条件与作用力无需模拟,在一定程度上代表了细胞内的真实情况。③简洁性。融合蛋白互相作用后,减少了纯化蛋白质的繁琐步骤。④广泛性。酵母双杂交系统可采用不同组织器官细胞类型和分化期的材料构建cDNA文库,能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质,适用于部分细胞质,细胞核及膜结合蛋白。4录激活活性剂酵母双杂交系统在研究蛋白-蛋白、蛋白-核酸间互相作用方面快速有效,有广泛的应用,但也存在一些局限性。它有些弊端是不容忽视的,“假阳性”是酵母双杂交的一个重要问题。由于某些蛋白质本身具有激活转录功能或在酵母内表达时的转录激活作用,使prey-BD融合基因与bait-AD融合基因表达产物无需特异结合,就能启动转录系统。另外有些蛋白质表面有对其他蛋白质的低亲和力区,容易形成蛋白体复合物,能够引起报告基因的表达,使酵母表现出相应的表形,产生假阳性结果。所分析的可能互相作用的蛋白质必须定位于核内,才能激活报告基因,但是很多蛋白质的相互作用依赖翻译后加工如二硫键等的形成等,而此过程要在细胞质内完成,这样,有许多蛋白质不适用此方法。某些诱饵蛋白质或待筛选蛋白质在酵母中大量表达时,可能对酵母产生一定的毒性作用,如使酵母体内的信号传导通路阻断,干扰酵母中正常基因的表达调控,抑制酵母细胞的分裂,甚至使酵母细胞在选择性培养基上不能生长等,使得某些种类的蛋白质不能在该系统中进行分析。5关于母亲饲料系统的进一步发展和展望5.1酵母单杂交序列的制备基于酵母双杂交系统提出单杂交系统提出单杂交系统,用于研究DNA-蛋白质间互相作用。不同之处仅在于它省略了双杂交系统中bait-BD蛋白杂代之交体,代之以具有与之特异结合位点的DNA,可以利用DNA序列捕获具有与之特异结合的结构域的蛋白质。通过对酵母细胞内报告基因的表达状况的分析,来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因,或对DNA结合位点进行分析。运用此技术能快速筛选到与DNA结合的蛋白质。酵母单杂交系统灵敏性高,可直接获得与DNA特异结合蛋白质的基因序列。与双杂交类似,同样也会出现假阳性问题,有待进一步完善。5.2分子传导作用三杂交系统是SenGupta等发展起来的,与双杂交系统相似,只是2个杂交蛋白需通过第三个分子介导。三杂交必须满足:2个蛋白无直接作用,必须通过第三个成分才能激活转录,第三个分子具有2个蛋白的位点。许多细胞内信号传递过程中,两蛋白间互相作用涉及第三个分子。而这第三种分子可以是蛋白质,小分子多肽和核酸。因此,此方法的发明大大扩展了酵母双杂交系统的应用范围。5.3作用的因素酵母双杂交系统创立的初衷是研究蛋白间互相作用,如果这种作用很重要,那么解离作用必然导致对生物的重大影响,而研究阻断蛋白之间的相互作用的因素也就很重要。逆向双杂交系统由Shih等创立,可作为酵母双杂交系统较好的补充。与酵母双杂交系统比较,突出的特点在于构建一种反向筛选报告基因即蛋白间特异相互作用所激活的报告基因能阻碍转化体的生长,从而发现蛋白间结合的解离因素。Shih等用该系统对阻断环腺苷酸效应分子结合蛋白与辅助因子相互作用的诱变剂进行了研究。Vidal等据此发现了影响转录因子E2F1中与DP1相互作用的点突变。5.4成为选定的方法之一,即成为选定的方法从酵母双杂交系统理