菠萝品种SSR标记鉴定技术规程

菠萝品种SSR标记鉴定技术规程范围本标准拟规定利用简单重复序列（SimpleSequenceRepeats，SSR）分子标记进行菠萝（Ananascomosus）品种鉴定的试验方法、数据记录与统计、判定标准。本标准主要技术内容包括样品的采集与制备、基因组DNA提取与纯化、DNA质量与浓度检测、核心SSR引物筛选、SSR-PCR反应与产物检测、等位变异数据记录与统计分析等。本标准适用于菠萝品种资源的DNA分子数据采集和品种鉴定。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则NY/T2594-2014植物品种鉴定DNA指纹方法总则术语和定义下列术语和定义适用于本文件。核心引物CorePrimers核心引物指多态性、稳定性、重复性等综合特性好、作为DNA指纹鉴定优先选用的一套引物。核心引物作为统一用于DNA指纹数据库构建和品种鉴定的引物，可保证不同实验室数据具有可比性。参照品种Referencevariety参照品种指对应于SSR位点不同等位基因的一组品种。参照品种用于确定待测样品在某个SSR位点上等位基因扩增片段的大小，校正不同仪器设备和不同实验室间检测数据的系统误差。原理简单重复序列（SSR）分布于菠萝整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两端的序列设计一对特异引物，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。根据PCR产物的带型差异鉴定菠萝品种。仪器设备及试剂仪器设备及试剂名单见附录A。试剂和溶液配制相关溶液配制方法见附录B。引物本标准已利用菠萝基因组和转录组开发出菠萝SSR标记引物300对，并通过SSR引物筛选，获得具有高度多态性的核心引物13对（名单见附录C）。操作程序参照品种与样品准备参照品种信息见附录D。对于种子样品的分样和保存，按照GB/T3543.2的规定进行。样品准备每份样品至少随机检测5个个体（种子、幼嫩叶片等组织或器官），每个个体单独分析。对一致性差的样品应增加检测个体至10个以上，每个个体单独分析。DNA提取采用改良CTAB法提取基因组DNA：（1）取400mg植株嫩叶，加入适量PVP于液氮中充分研磨成细粉末，置于2.0mL离心管中。（2）加入1mL预冷的CTAB-free缓冲液，振荡混匀后冰浴10～30min。室温，5000rpm离心10min，弃上清，重复1～2次。（3）加入1mL65℃预热的2～3×CTAB提取液，充分轻混匀，65℃水浴30～40min，其间颠倒数次。（4）室温，12000rpm离心10min，取上清，加入1/10体积（100µL）65℃预热的CTAB/NaCl溶液，混匀后加入等体积（900µL）氯仿/异戊醇（24：1）抽提。（5）室温，12000rpm离心10min，取上清，加入等体积（850µL）的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）充分轻混匀。（6）室温，12000rpm离心10min，取上清，加入等体积（800µL）的氯仿/异戊醇（24:1），充分轻混匀。（7）室温，12000rpm离心10min，取上清，加入1/2体积（350µL）NaCl（5M）及等体积（700µL）预冷的异丙醇（−20℃），−20℃静置30min。（8）室温，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀分别用1mL预冷的无水乙醇和75%乙醇（−20℃）漂洗1～2次。（9）加入500µL去离子水溶解沉淀，并加入2～5μlRNase溶液（10mg/mL），摇匀，37℃温育30～40min。（10）加入等体积（500µL）的氯仿/异戊醇（24:1）充分轻混匀，12000rpm离心10min，取上清，加入1/10体积（50µL）3MNaAc（pH5.2）和等体积（500µL）异丙醇，充分轻混匀，−20℃静置30min。（11）室温，12000rpm离心10min，沉淀分别用1mL预冷的无水乙醇和75%乙醇（−20℃）漂洗1～2次。（12）室温，12000rpm离心10min，去上清，超净台上晾干DNA沉淀，然后溶于150µlddH2O，4℃冰箱保存或−20℃长期保存备用。PCR扩增标准样品的使用在进行PCR扩增和等位基因检测时，应同时包括相应的标准样品。不同位点的标准样品的名称见附录C。某一位点上具有相同的等位基因的标准可能不止一个，在确认这些样品在某一位点上的等位基因大小后，也可将这些样品代替附录C中的标准样品。对于附录C中未包括的等位基因，应按本标准的方法，通过使用DNA分析仪与标准样品同时进行检测确定其大小。同一名称不同来源的标准样品在某一位点上的等位基因可能不相同，在使用前应与原标准样品进行核对。注：多个品种在某一位点上可能具有相同的等位基因。在确认这些品种某一位点上等位基因大小后，这些品种也可以代替附录C中的标准样品使用。反应体系利用单因素试验设计，针对影响PCR反应体系的5个主要因素进行反应体系优化及其验证，最终获得菠萝最优SSR-PCR反应体系：包括基因组DNA20.0ng，1×Buffer缓冲液（含Mg2+），dNTPs2.5mmol/L，正、反向引物各30ng，Taq酶0.5U，其余以超纯水补足。推荐使用15μL~20μL反应体积。反应程序94℃预变性4min，94℃变性30s，52～55℃（具体退火温度见附录C）退火30s，72℃延伸40s；共35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。等位基因检测变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测清洗玻璃板将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板相互污染。组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。灌胶取60mL6%的聚丙烯酰胺胶（根据不同型号的电泳槽确定胶的用量和合适的灌胶方式），300μL过硫酸铵（APS）和60μL四甲基乙二铵（TEMED）轻轻混匀，将胶缓缓的灌入。当胶到底部后将板放置水平。将梳子插入适当位置，并用夹子夹紧，以防点样时漏样。聚合2h以上用于电泳。过程中防止出现气泡。预电泳将梳子小心拔出，用洗瓶清洗干净，然后擦干净玻璃板，将电泳槽装配好后，在电泳槽中加入1×TBE。在恒功率70W条件下预电泳30min。变性在PCR产物中加入3μL6×加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，然后立即置于冰上冷却，使DNA保持单链状态。电泳预电泳结束后，将胶面的气泡及杂质吹打干净，将梳子轻轻插入，其深度为刚进胶面1mm。每一个加样孔点入5μL样品。70W恒功率电泳至上部的指示带到达胶板的中部。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上。银染（快速银染法）a）固定：固定液中轻轻晃动3min，需要固定2次，第2次固定液回收待用；b）染色：染色液中染色12min；c）漂洗：蒸馏水漂洗一次30s，第2次用双蒸水快速漂洗，30s；d）显影：显影液中轻轻晃动至带纹出现；e）定影：用回收的固定液定影2min；f）漂洗：双蒸水漂洗1min。毛细管电泳荧光检测样品准备首先根据不同的荧光基团将PCR产物稀释一定的倍数。一般6-FAM荧光基团PCR产物稀释80倍，HEX、ROX、TAMRA荧光基团PCR产物稀释30倍。然后分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1.0μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μLLIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。除待测样品外，还应同时包括标准样品的扩增产物。将样品在PCR仪上95℃变性5min，立即取出置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后上机电泳。开机准备打开DNA分析仪，检查仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶。将装有样品的微孔板置放于样品架基座上。打开数据收集软件。编辑电泳板点击菜单中的“platemanager”按钮，然后在右侧窗口点击“New”按钮创建一个新的电泳板，在“Name”和“ID”栏中输入电泳板的名称，在“application”选项中，选“Genemapper-Genetic”，在“PlateType”选项中选择“96-well”，在“owner”和“operator”项中分别输入板所有者和操作者的名字，点击“OK”按钮。电泳在“Runscheduler”工具栏中，点击“Search”按钮，选中已编辑好的电泳板，点击样品板，使电泳板和样品板关联，然后点击工具条中左上角的绿色三角按钮，开始电泳。等位基因数据采集数据格式样品每个SSR位点的等位基因采用扩增片段大小的形式表示。变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将待测样品扩增片段的带型和泳动位置与对应的标准样品进行比较，与待测样品相同的标准样品的片段的大小即为待测样品该引物位点的等位基因扩增片段大小。毛细管电泳荧光检测使用DNA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位基因扩增片段大小数据。通过使用标准样品，消除同型号不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差。比较标准样品的等位基因扩增片段大小数据与表C1中的数据。如两者不一致，其差数即是系统误差的大小。从待测样品的等位基因扩增片段数据中除去该系统误差，获得的数据即为待测样品的等位基因扩增片段大小。结果记录纯合位点的等位基因扩增片段数据记录为XXX/XXX，其中XXX为该位点等位基因扩增片段大小；杂合位点的等位基因扩增片段数据记录为XXX/YYY，其中XXX、YYY分别为该位点上两个不同的等位基因，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点的等位基因数据记录为0/0。示例1：一个品种的一个SSR位点为纯合位点，等位基因扩增片段大小为120bp，则该品种在该位点上的等位基因扩增片段数据记录为120/120。示例2：一个品种的一个SSR位点为杂合位点，两个等位基因扩增片段大小分别为120bp、126bp，则该品种在该位点上的等位基因扩增片段数据记录为120/126。判定标准品种鉴定包括对两个或两个以上的品种同时进行检测（“直接比较”）和对待测品种进行检测后利用其检测数据和数据库中品种的数据进行比对（“数据库比对”）两种情况。直接比较对待测品种和对照同时进行检测（“直接比较”）时，用附录C中核心引物检测，获得待测品种在这些引物位点的等位基因数据，利用这些数据进行品种间比较：a）品种间差异位点数≥2，判定为不同品种；b）品种间差异位点数＝1，判定为近似品种；c）品种间差异位点数＝0，判定为疑同品种。对于b）和c）的两种情况，应按照GB/T19557.1给出的原则进行田间测试，确定品种间在形态性状上是否存在明显差异。数据库比较对待测品种进行检测后利用其检测数据和数据库中品种的数据进行比对（“数据库比对”）时，用附录C中核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位基因数据，利用这些数据和数据库中的品种进行比较：a）品种间差异位点数≥2，判定为不同品种；b）品种间差异位点数＝1，判定为近似品种；c）品种间差异位点数＝0，判定为疑同品种。对于b）和c）的两种情况，将这些相近品种或疑同品种与待测品种按照11.1的方法进行鉴定。

（规范性）

仪器设备及试剂仪器设备PCR扩增仪。电泳槽及配套的制胶附件。高压电泳仪。水平摇床。胶片观察灯。电子天平。微量移液器。磁力搅拌器。电磁炉。微波炉。高压灭菌锅。酸度计。台式高速离心机。制冰机。凝胶成像系统或紫外透射仪。DNA分析仪：基于毛细管电泳，有DNA片段分析功能和数据分析软件，能分辨1个核苷酸的差异。水浴锅或金属浴：控温精度±1℃。冰箱：最低温度-20℃。紫外分光光度计。试剂十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）。三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）。浓盐酸。氢氧化钠（NaOH）。10×Buffer缓冲液（含Mg2-）。四种脱氧核苷酸：4×dNTP。TaqDNA聚合酶。去离子甲酰胺。溴酚蓝。二甲苯青FF。甲叉双丙烯酰胺。丙烯酰胺。硼酸。尿素。亲和硅烷：97%。剥离硅烷：2%二甲基二氯硅烷。无水乙醇。四甲基乙二胺（TEMED）。过硫酸铵（APS）。冰醋酸。硝酸银。甲醛。氯仿。异戊醇。异丙醇。DNA分析仪用分子量内标，LIZ-500分子量内标。DNA分析仪用丙烯酰胺胶液（POP-4胶）DNA分析仪用光谱校准基质，包括6-FAM、TAMRA、HEX和ROX4种荧光标记的DNA片段。DNA分析仪专用电泳缓冲液。

（规范性）

溶液配制DNA提取溶液的配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）（pH=8.0）溶液称取186.1gEDTA-Na2溶于800mL蒸馏水中，用固体NaOH调至pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）（pH=8.0）溶液称取60.55gTris碱溶于适量水中，加HCl调至8.0，定容至500mL，高压灭菌。0.5mol/L盐酸（HCl）溶液量取25ml浓盐酸（36%~38%），加水定容至500mL。DNA提取液称取CTAB20g，NaCl81.816g，PVP20g，量取1mol/LTris-HCl（pH=8.0）100mL，0.5mol/LEDTA溶液（pH=8.0）40mL，定容至1000mL。5mol/L氯化钠（NaCl）溶液称取146g固体NaCl溶于水中，加水定容至500mL。氯仿-异戊醇（24:1）按24:1的比例（体积比）配制混合液。PCR扩增溶液的配制dNTP用超纯水分别配制A、G、C、T终浓度100mmol/L的储存液。各取20μL混合，用超纯水720μL定容至终浓度2.5mmol/L的工作液。SSR引物根据合成后引物浓度，用超纯水分别配制正向引物和反向引物终浓度均为100μmol/L的储存液，各取10μL混合，用超纯水80μL定容至终浓度10μmol/L的工作液。引物干粉配制前应首先快速离心。6×加样缓冲液称取溴酚蓝0.125g、二甲苯青0.125g，量取去离子甲酰胺49mL、0.5mol/L的EDTA溶液（pH=8.0）1mL。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制40%PAGE胶称取丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500mL。6.0%PAGE胶称取尿素420g，量取10×TBE缓冲液100mL，40%PAGE胶150mL，定容至1000mL。亲和硅烷量取49.75mL无水乙醇和250μL冰醋酸，加水定容至50mL。亲和硅烷工作液在1mLBind缓冲液中加入5μLBind原液，混匀。剥离硅烷工作液2%二甲基二氯硅烷。10%过硫酸铵溶液称取0.1g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。10×TBE缓冲液称取Tris碱108g，硼酸55g，量取0.5mol/LEDTA溶于37mL，定容至1000mL。1×TBE缓冲液量取10×TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。银染溶液的配制固定液量取5mL冰醋酸、100mL乙醇，加水定容至1000mL。染色液称取1g硝酸银，加水定容至1000mL。显影液量取1000mL蒸馏水，加入10g氢氧化钠和2mL甲醛。

（规范性）

核心引物核心引物及参照品种见表C。SSR核心引物及菠萝参照品种引物名称引物序列（5’→3’）荧光染料退火温度℃等位基因bp参照品种PS3tgctccATGCTCTTGTCCTATGGGGTAAGCAAAAGATGCT5’6-FAM53253269262牛奶菠萝牛奶菠萝金钻菠萝PS5CCCATCTCTCTCCTTTTCCCGTGCTGGCCTTCATCTCCT5’6-FAM55160163170神湾金菠萝金菠萝PS18CTGGAACACGCACATAAGGATTATGCACAGCTCCAGGTTG5’6-FAM55266280283286剥粒菠萝无眼菠萝台农1号冬蜜菠萝PS27CAACAATCCCCCAGATCCTAATCCTGCTTGAACGAAGACG5’HEX55159168冬蜜菠萝黄金菠萝PS30CTACACCTCCCATTCCCCCTATAGTTGATTCCCGCCCTCT5’HEX52163180182168190黄金菠萝黄金菠萝金艳牛奶菠萝糖心菠萝PS35tagagcCTTTTCTTTGGGCAggtggtgtAGGCGTAGGTGT5’HEX53267270385X脆无刺卡因神湾PS44CCCCATCTCACGTTCTCTTCAAGCTCCAGCACCTTCCTCT5’HEX55242251245249芒果菠萝芒果菠萝糖心菠萝糖心菠萝PS46TAAGCCTGATCTCGTcccatGAATTGGGATTCGGAAGGAT5’HEX53207222无眼菠萝香水菠萝PS48CCCCAATTCTTCCTCAACCTGGGGAAAAGCTGATCCAAAT5’HEX53173182179香水菠萝香水菠萝金钻菠萝PS50TTCGAGGAGGACTCGAAAGACGGTTCATGTTTTCCTGAGC5’ROX55170173金菠萝巴厘PS52ATTACGGCGAACATCACCTCAAATTGGGGGAAAGAACGTC5’ROX55280287289香水菠萝珍珠珍珠PS56CTCAAGAACATCTGGACCGCACCTCGTCGACCGTCTTCT5’ROX55229240231237239巴厘巴厘XX有刺牛奶菠萝Everich菠萝PS64CATAAGAGGCAGAGGCGGtCCGTTTGTTCGTCGACCTAT5’ROX55264275芒果菠萝剥粒菠萝PS73gctTTGTTGGCCACTTCTCTGGGGAAAGGagatacccaaa5’TAMRA53230241甜蜜蜜菠萝西瓜菠萝PS86AATTAGATTTGAGtgaacccccGGTTCTTTGGcatctctcca5’TAMRA55181187Sweet16菠萝黄金菠萝PS94GCTGTACGGGCCGATGTAcgtGTGGGACGATTTAGCTATT5’TAMRA53234240程溪菠萝苹果菠萝PS107CCACGTCACCATACCTTTCCATTGCGGCGTCTTCTGTATC5’TAMRA53276279苹果菠萝冬蜜菠萝PS110CTTCTCCCCTCCCTCCATACGATAGCCGCTCACTCACCTC5’TAMRA56155165163171XX有刺XX有刺牛奶菠萝牛奶菠萝

（规范性）

参照品种名单参照