青霉素几种分离纯化方法比较

./生物工程下游技术期末作业青霉素的分离提纯方法的发展与比较摘要：本文主要介绍了青霉素的分离提纯方法的发展以及比较,包括传统的方法,如吸附法,沉淀法,溶剂萃取法等,也包括现代发展的高新技术,如反胶团萃取法,乳状液膜法,中空纤维更新液膜法以及其它的高效提取方法。Abstract：ThispaperdescribesthedevelopmentofpenicillinGandthecomparisonofmethodsofseparationandpurification,includingtraditionalmethods,suchasadsorption,precipitation,solventextraction,butalsoincludesmodernhigh-techdevelopment,suchasreversemicellesextraction,emulsionliquidmembranehollowfiberrenewalliquidmembraneextractionandotherefficientmethods.正文：1、青霉素简介1、1基本性质：青霉素〔Benzylpenicillin/Penicillin又被称为青霉素G、peillinG、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种,是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素,是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β-酰胺类中一大类抗生素的总称。分子式为：1、2发展历程：早在唐朝时,长安城的裁缝会把长有绿毛的糨糊涂在被剪刀划破的手指上来帮助伤口愈合,就是因为绿毛产生的物质〔青霉素素菌有杀菌的作用,也就是人们最早使用青霉素。近代,1928年英国细菌学家弗莱明首先发现了世界上第一种抗生素—青霉素,1941年前后英国牛津大学病理学家霍华德·弗洛里与生物化学家钱恩实现对青霉素的分离与纯化,并发现其对传染病的疗效,弗莱明、弗洛里、钱恩三人共同获得1945年诺贝尔奖。目前所用的抗生素大多数是从微生物培养液中提取的,有些抗生素已能人工合成。由于不同种类的抗生素的化学成分不一,因此它们对微生物的作用机理也很不相同,有些抑制蛋白质的合成,有些抑制核酸的合成,有些则抑制细胞壁的合成。[1]1、3化学性质：青霉素可以与金属或有机碱结合成盐,常有钠盐、钾盐、普鲁卡因盐和节星盐。青霉素盐的化学名称是<25,SR,6R>一3,3一二甲基一6一<2一苯乙酞氨基>7一氧代一4-硫杂一1一氮杂双环[3.2.0]庚烷一2一甲酸钠<钾>盐"青霉素的钠盐!钾盐均为白色结晶粉末;无臭或微有特异性臭,有引湿性;遇酸碱或氧化剂迅速失效,在水中极易溶解乙醇中微溶。[2]1、4分类：青霉素用于临床是40年代初,人们对青霉素进行大量研究后又发现一些青霉素,当人们又对青霉素进行化学改造,得到了一些有效的半合成青霉素,70年代又从微生物代物中发现了一些母核与青霉素相似也含有β－酰胺环,而不具有四氢噻唑环结构的青霉素类,可分为三代：第一代青霉素指天然青霉素,如青霉素G〔苄青霉素；第二代青霉素是指以青霉素母核－6－氨基青霉烷酸〔6－APA,改变侧链而得到半合成青霉素,如甲氧苯青霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素；第三代青霉素是母核结构带有与青霉素相同的β－酰胺环,但不具有四氢噻唑环,如硫霉素、奴卡霉素。按其特点可分为：青霉素G类、青霉素V类、耐酶青霉素、氨苄西林类、美西林及其酯匹西林、甲氧西林类。1本文主要针对青霉素G的分离提纯方法进行综述。青霉素G分离提纯方法比较2、1传统的分离提纯方法青霉素的大规模生产采用的是生物发酵法,其分离提纯包括过滤、提取、共沸结晶等工序。传统的青霉素发酵液提取工艺主要有吸附法、沉淀法、溶剂萃取法、离子交换和树脂吸附法,目前在青霉素提取中普遍采用的是溶剂萃取法。2、1、1吸附法吸附法系利用吸附剂与抗生素之间的分子间吸引力而将抗生素吸附在吸附剂上。吸附剂有活性炭、三氧化二铝、白土、大孔吸附剂等,其中以活性炭应用得最早。有研究表明在较低的pH值下,青霉素v可以吸附到中性的芳香族吸附剂上,并且随着pH值的降低,青霉素v的吸附量增加,而在较高的pH值下,青霉素V易溶于水,几乎无法利用青霉素V被吸附的特点来吸附提取,由于青霉素V是热敏性物质,且稳定性差,吸附法由于操作周期较长而造成青霉素的损失,所以只进行了实验室规模的研究。2、1、2沉淀法沉淀法是分离抗生素的最简单而经济的方法,浓缩倍数高。它是利用抗生素能和某些无机、有机离子或分子形成复合物而沉淀,此外也可利用本身的等电点沉淀析出,然后将沉淀物在适宜的条件下,再进行分离精制而得到提纯的目的。青霉素生产可以通过加入无毒的弱酸或部分有机强酸到青霉素发酵滤液或盐溶液中调节pH值获得酸性相对较弱的酸离解常数常选择在<1.3一6.6>×10一5的一元脂肪酸,如乙酸、丙酸等,或二元脂肪酸,如丁二酸等,强酸的离解常数至少为1.7xl0-1如硫酸、盐酸、磷酸、柠檬酸等,酸化过程中强酸的存在可以使青霉素沉淀完全,为了获得较高的收率,通常先加入弱酸,然后缓慢加入强酸或部分强酸与弱酸同时加入,大部分青霉素沉淀后,加入剩余的强酸。利用沉淀法直接从发酵液中回收分离和提纯青霉素优点很多,如节省或不用溶媒,收率高;操作费用降低;设备简单,工艺路线短;对经基青霉素酸化后存在于液相中等但是在青霉素酸化过程易形成豁性的油状物,过滤处理存在一定的问题。2、1、3溶剂萃取法溶媒萃取法<液一液萃取法>:当抗生素以不同的化学状态存在于<游离酸或游离碱状态>与水不溶性的溶媒中,有不同的溶解度,利用分配系数不同而达到浓缩和提纯的目的。在较低的pH值时,大部分青霉素G以未解离酸分子形式存在,在水中溶解度较低但易溶于有机溶剂,因此可用溶剂萃取技术提取青霉素。溶剂萃取分物理萃取和反应萃取两大类"目前在青霉素提取过程中普遍采用的是碳一键合氧给予体类型的萃取剂,即碳氢化合物和取代的碳氢化合物溶剂,在pH值为2.0左右进行萃取青霉素,萃取收率服从分配定律,称为物理萃取。工业上一般采用醋酸丁醋为萃取剂,在pH值1.8一2.2时进行萃取生产,青霉素在一定酸性条件下呈游离酸状态,在醋酸丁醋中的溶解度远大于在水中的溶解度,青霉素从水相转入醋相,水溶性杂质留在水相"把互不相溶的醋相与水相分开后就实现了水溶性杂质与青霉素的分离"工业上的提炼流程如下:2、1、4离子交换和树脂吸附法青霉素G的生产采用生物合成法,其分离提纯过程包括过滤!提取!共沸结晶等一系列分离和纯化过程。近年来,随着青霉素扩产,产量激增,造成供过于求的状况,为了提高行业竞争力,科技工作者围绕完善现有萃取过程和进行新技术开发两个方面进行了大量研究工作,青霉素提纯工艺的进展主要集中在改进工艺、方法、设备几方面,离子交换法系利用离子交换树脂和抗生素之间的化学亲和力,有选择性的将抗生素吸附上去,然后用较少量的洗脱剂将它洗下来,从而达到浓缩和提纯的目的。目前,离子交换和树脂吸附技术主要用于从青霉素提取,结晶后得到的废液中回收青霉素以及在青霉素水解生产6~ARA过程中去除苯乙酸以降低其浓度,离子交换和树脂吸附技术用于青霉素提纯,收率偏低,解吸困难,并且其规模与产量很难适应青霉素的大规模生产。[3]2、2新型青霉素G提取方法2、2、1双水相萃取双水相分配技术是近年来发展起来的提取和纯化生物活性物质的新型分离方法之一,一般而言,双水相系统是指把两种聚合物或一种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起,由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性而形成互不相溶的两相。近年来,一种新型绿色溶剂——离子液体的出现引起各国学者的广泛关注.离子液体是指在由离子组成的室温时呈液态的液体,一般由有机阳离子和无机阴离子组成.改变阴阳离子组成,可以合成不同性质的离子液体,被称为"设计者溶剂".。离子液体几乎没有蒸气压,不挥发.,离子液体分为疏水性和亲水性两种类型,研究表明,疏水性离子液体萃取红霉素得到很好的效果。庆芬[4]等以亲水性离子液体[Bmim]BF4和NaH2PO4·2O水溶液形成的双水相体系为研究象,考察了影响双水相形成的因素以及青霉素G的萃取特性.特别考察了NaH2PO4浓度、青霉素浓度以及[Bmim]-BF4的浓度对双水相的形成和萃取率的影响,同时考察了萃取体系pH值变化以及乳化现象。结果发现：<1>离子液体双水相可以有效萃取青霉素,轻相中青霉素萃取率可达93.7%.萃取率受成相盐浓度、初始青霉素浓度以及离子液体浓度的影响.萃取的最佳参数为NaH2PO4·2H2O36%~38%<质量分数>、青霉素浓度50000u/mL、离子液体40%~45%<体积分数>.。离子液体双水相萃取青霉素是一项高效分离青霉素的新技术。<2>离子液体双水相体系萃取青霉素的pH值在4~5之间,为弱酸性,青霉素降解率降低,萃取收率提高.。萃取过程不发生乳化现象,有利于两相分离。2、2、2反萃取法2、2、2、1连续反萃取连续反萃取是根据BA中青霉素含量把碳酸氢钾水溶液按一定比例加入到混合罐,进行充分混合反应,而后用离心机进行分离,得到RK。连续反萃取BA和碳酸钾是连续加入,混合液不断进入离心机进行分离,整个过程是连续性操作,由于BA效价是变化的,所以碳酸钾水溶液的加入量要随时进行调整,以控制PH值。在生产过程中造成PH值大围的波动,影响收率和产品质量。为了减小PH值的波动,通常采用低浓度的碳酸氢钾水溶液进行反萃取。得到的RK效价偏低,通常在60万、1/ml以下。2、2、2、2间歇反萃取间歇反萃取是在混合罐中一次性加入一定量的BA,经计算加入适量的碳酸氢钾水溶液,进行充分混合,使之完全反应,再静止分层。此时萃取液是在重力作用下分层的,分离后得到RK。在这个过程中,首先测定混合罐中的BA效价,再依照公式进行计算,得出加入碳酸氢钾水溶液的量,所以能准确地控制PH值。由于PH值易于控制,可以提高碳酸氢钾溶液的浓度,以达到提高RK效价的目的。RK效价可以提高到80万u/ml左右。梁玉等[5]通过对这两种工艺的研究比较得到如下的数据表格,表明间歇反萃取方法分离提纯青霉素G的效力更好。2、2、3反胶团萃取反胶团是一种新型生物活性物质的分离方法,最初应用于具有鲜明等电点的氨基酸、蛋白质类物质的分离。吴子生[6]等在室温和pHS一8的条件下进行了青霉素G的反胶团相转移提取研究,提取率在90%以上"离子强度及pH对青霉素萃取率,反萃取率的影响不大,但是离子强度对蛋白质的萃取率影响很大,因此可利用这些特点将杂蛋白除去。2、2、4超临界流体萃取超临界流体萃取是新型的提取技术,它以超临界条件下的气体作为萃取剂,从液体或固体中萃取出某些成分并进行分离,与一般液体萃取相比,S死的萃取速率和围更为扩大,选择适宜的溶剂如CO2,可在较低温度或无氧环境下操作,分离、精制热敏性物质和易氧化物质;SFE还具有良好的渗透性和溶解性,能从固体或粘稠的原料中快速提取有效成分;无溶剂污染,且回收溶剂无相变过程,能耗低;兼有萃取和蒸馏的双重功效。[2]但由于超临界流体萃取法中青霉素的溶解度较低,利用超临界流体从发酵液中提取抗生素还有待进一步研究。2、2、5膜分离技术邵文尧[7]等在对膜技术的研究中发现膜通量、加水及洗涤效果、滤液质量及过滤收率、清洗及系统运行的稳定性对于膜过滤的效率有很大影响。而运用膜过滤滤技术与其它过滤方法相比具有以下优越性:过滤时无须添加絮凝剂,节省了大量絮凝剂成本的支出;过滤收率高,损失较少;滤液质量高,澄清透亮,不乳化;由于采用菌丝体与大部分蛋白一步截留过滤法,操作工艺流程简化,操作成本降低;系统实行系统封闭过滤,且可实现全自动控制,滤液不受人为污染,排渣无须手动,操作劳动强度减轻;由于系统独特的结构设计、系统设计及配套的清洗方案,使系统的稳定性、效率、抗污染能力及适用于高粘度料液过滤的能力较其它过滤方法具有显著的优越性。2、2、5、1微滤和超滤青霉素G生产的第一步就是从发酵液中提取菌丝体,传统的提纯工艺采用过滤和昂贵的离心设备,这些工艺不但能耗高,由于分离过程中产品残留在菌丝体滤饼层,不能达到100%的回收率,需要后续的深度洗脱、微滤和超滤技术目前己应用于发酵液中青霉素的提纯。2、2、5、2中空纤维更新液膜萃取技术中空纤维膜萃取器是指萃取器中包含一束具有微孔的中空纤维,两种液相分别在纤维的侧<管程>和外侧<壳程>流动,两相界面固定于纤维壁的微孔中并调节适当的压力维持其稳定。纤维膜壁既做为防止乳化的屏障又起到两相通过膜孔进行传质的支撑体的作用,中空纤维膜萃取技术能够克服液膜萃取稳定性差的缺点,同时由于其非分散性使得该萃取过程不会产生乳化现象,由于没有混合,也不存在分相的问题,且传质效率较高,用于萃取性分离过程时,其过程设计及放大比传统的分散型装置简单。高磊[8]等以有机磷类萃取剂为载体,对中空纤维更新液膜萃取溶液中青霉素G的过程进行研究。采用依靠中性络合萃取的TBP对青霉素G有较好的萃取性能,可作为有机液膜相的载体；水溶性性小、有破乳和协萃作用的异辛醇可作为液膜相添加剂。确定了TBP-异辛醇-煤油为体系的中空纤维更新液膜萃取青霉素G的工艺过程。研究结果表明,管程混合流体中有机相在水相中的含量对过程传质性能的影响较小；由于随着中空纤维膜器管程流体流速的增大,两相的接触时间减小,液膜过程的传质通量下降,料液相中青霉素G的去除率降低；而随着壳程流速的增大,壳程料液侧水相过界层变薄,水相边界层的传质阻力减小,过程的传质通量增大,料液侧青霉素G的去除率增大。2、2、5、3液膜技术液膜萃取技术用于青霉素提取可实现萃取/反萃取过程祸合,是当前青霉素分离领域的另一个研究热点,其技术原理都是在料液相和反萃相之间引入一层与料液相和反萃相不相混溶的萃取相液膜,利用这一液膜实现分隔两相并对溶质分子进行选择性传递的作用,溶质分子在浓差推动力的作用下,从料液相主体扩散迁移到料液相与液膜相的界面,进入液膜相;在液膜经扩散到达液膜与反萃相的界面,再进入反萃相。该方法也被称为同级萃取一反萃过程,在这一过程中,促使溶质分子跨过液膜进行传质的推动力是料液相与反萃相之间的浓度或pH值差。用于青霉素提取的液膜萃取技术主要是乳化液膜<ELM>、