3,5-二氟苯乙酰-l-丙氨酰-s-苯基甘氨酸-丁酯对人牙髓细胞的体外抑制作用

3,5-二氟苯乙酰-l-丙氨酰-s-苯基甘氨酸-丁酯对人牙髓细胞的体外抑制作用

信号通道与牙齿髓的迁移、殖长和分化过程密切相关。γ-分泌酶是Notch信号转导过程中释放Notch受体胞内段(notchintracellulardomain,NICD)这一关键步骤的关键酶。多种研究表明应用γ-分泌酶抑制剂可有效抑制其活性,导致不能水解出NICD,阻断其激活下游基因的表达,从而影响细胞的一系列生命活动。应用γ-分泌酶抑制剂的方法因其发展成熟、容易获得、操作相对简单被较多应用于Notch信号通路的研究。目前尚未见γ-分泌酶抑制剂用于人牙髓细胞的相关研究。本研究通过体外培养人牙髓细胞,在正常培养基中加入γ-分泌酶抑制剂3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸t-丁酯{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester),DAPT},探讨DAPT对人牙髓细胞Notch信号通路是否有抑制作用,及对牙髓细胞增殖能力的影响。1数据和方法1.1试剂和试剂盒胎牛血清,高糖型DMEM培养基,青霉素10000U/mL,链霉素10000mg/L,L-谷氨酰胺200mmol/L,Ⅰ型胶原酶,0.25%(质量分数)胰蛋白酶-EDTA,以上均购自美国GIBCO公司;DAPT购自美Sigma公司;二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)购自美国Sigma公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoliumbromide),MTT]粉末购自美国Amresco公司;焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)购自美国Amresco公司;TRIZOL购自美国Invitrogen公司;SuperScriptⅢFirststrand试剂盒(18080-051)购自美国Invitrogen公司;PowerSYBRGreenPCRMasterMix(4367659)购自英国AppliedBiosystems公司。1.2实验中引用的物品引物采用PrimerPremier5.0软件设计扩增,上海生工生物技术公司合成(表1)。1.3人牙髓细胞的培养本研究采用3个不同来源的人牙髓细胞独立实验,重复3次。人牙髓细胞来源:(1)23岁女性,因阻生拔除的左下第三磨牙;(2)22岁男性,因阻生拔除的左上第三磨牙;(3)14岁女性,因正畸减数拔除的右下第一前磨牙。以上3例均来自北京大学口腔医学院·口腔医院颌面外科门诊,并取得患者及家属的知情同意。同一颗牙齿来源的牙髓细胞被分为以下3组:(1)空白组:人牙髓细胞使用正常培养基体外传代培养;(2)实验组:正常培养基中加入γ-分泌酶抑制剂DAPT,终浓度为5μmol/L;(3)阴性对照组:正常培养基中与实验组同步等量添加DAPT的溶剂DMSO。正常培养基为:高糖型DMEM培养基,青霉素100U/mL,链霉素100mg/L,L-谷氨酰胺2mmol/L,15%(体积分数)胎牛血清,pH值为7.0～7.2。人牙髓细胞的原代培养方法同Zou等的研究方法。收集临床上完整拔除的健康前磨牙或第三磨牙,采用酶消化法进行人牙髓细胞的原代培养。每次传代为细胞长至80%～90%汇合,并按照3×105个/瓶的密度接种于新的50mL培养瓶,依此方法连续培养传代。从第4代开始,分别于实验组和阴性对照组同步加入等量DAPT和DMSO,隔天换新鲜培养液。根据人牙髓细胞体外培养至第15代左右时出现增殖停滞的特点,本研究选取第4代、第8代和第10代,共计3个时点动态观察体外培养过程牙髓细胞增殖能力和Notch信号通路下游基因表达的变化。1.4逆转录及实时荧光定量pcr检测hes1基因表达水平提取第4代、第8代和第10代牙髓细胞的总RNA,采用SuperScriptⅢFirststrand试剂盒逆转录cDNA第一链合成。利用实时荧光定量PCR反应进行Hes1基因表达水平的检测。反应条件:50℃,2min;95℃,10min;95℃,15s,60℃,1min,40个循环。采用ΔΔCt方法分析数据,结果使用SPSS13.0软件,采用t检验进行数据分析,P<0.05为差异有统计学意义。1.5细胞裂解液的制备按照上述方法培养实验组和阴性对照组人牙髓细胞,处理至第10代,细胞汇合至80%～90%时弃培养液,用PBS洗涤细胞2遍,加2mLTRIZOL裂解细胞,摇匀,室温静置5min。用加样器吹打均匀,迅速将细胞裂解液吸到RNasefreeDEPC处理过的1.5mLEP管中,标记实验组和阴性对照组。在干冰条件下,将样本运送上海康成生物科技有限公司做NotchSignalingPathway的RT2ProfilerPCRArray(SuperArrayBioscience公司)的分析。采用上述ΔΔCt方法计算数据,比较实验组和阴性对照组Notch信号通路相关基因的表达差异。1.6细胞增殖曲线按照上述牙髓细胞培养代数检测点,于96孔培养板每孔中等量接种5×103个细胞,设置接种后第1、3、5、7天共4个时间点波长570nm测定细胞的D值,每个时间点设置6个复孔。以培养时间为横坐标,D值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。采用SPSS13.0统计软件处理数据,单因素方差分析法分析不同细胞代数细胞的D值。2结果2.1实验组细胞hes1表达量的比较加入γ-分泌酶抑制剂DAPT后,第4代实验组人牙髓细胞中Notch信号通路下游基因Hes1的表达量比阴性对照组低,与阴性对照组的比值为0.30,经t检验统计分析差异有统计学意义(t=37.538,P=0.001)。至第8代时,实验组细胞Hes1表达量与阴性对照组的比值为0.22,差异有统计学意义(t=29.125,P=0.001)。至第10代时,实验组细胞Hes1表达量降低,与阴性对照组的比值为0.20,差异有统计学意义(t=33.143,P=0.001,图1)。2.2s1、东南角、阴性对照组第10代实验组和阴性对照组牙髓细胞进一步做Notch信号通路相关基因的PCRArray芯片分析,结果显示:(1)加入DAPT后,同为Notch信号通路下游基因的Hes1、Hey1、NR4A2基因表达明显下降,与阴性对照组的比值分别为0.17、0.28和0.34。(2)Notch信号通路受体Notch1在实验组细胞中的表达高于阴性对照组,是阴性对照组的2.33倍;Notch信号通路配体JAG1(即Jagged1)、JAG2(即Jagged2)在实验组细胞中的表达也高于阴性对照组,分别是阴性对照组的2.44倍和3.45倍。(3)γ-分泌酶相关的PSEN2基因(即Presenilin2)表达差异,实验组细胞中PSEN2的表达是阴性对照组的2.19倍(图2)。2.3小鼠细胞中dapt检测结果加入DAPT后,第4代人牙髓细胞的实验组与阴性对照组的增殖曲线相近,在培养7d内实验组细胞增殖趋势未表现出与阴性对照组不同,各点D值差异均无统计学意义。其中,接种第1天,两组D值比较差异无统计学意义(t=2.076,P=0.065)。第3～7天,两组细胞D值均逐渐增高,实验组与阴性对照组细胞各时间点D值相近,t检验分析差异均无统计学意义,第3天,t=0.689,P=0.506;第5天,t=1.388,P=0.195;第7天,t=1.028,P=0.328。第8代阴性对照组细胞增殖较快,培养7d内D值逐渐升高,而实验组细胞增殖趋势较平缓,明显慢于阴性对照组细胞,各点D值差异有统计学意义。接种第1天,实验组与阴性对照组D值比较,差异无统计学意义(t=0.680,P=0.512)。从第3天开始,实验组细胞D值低于阴性对照组细胞D值,且两组差值随时间延长逐渐增大,t检验分析实验组和阴性对照组各点D值,其差异均有统计学意义。第3天时,t=3.995,P=0.003;第5天时,t=2.887,P=0.016;到第7天时,阴性对照组细胞D值已至0.256,而实验组细胞D值则仅为0.160,低于阴性对照组,差异有统计学意义(t=3.024,P=0.013)。第10代实验组细胞和阴性对照组细胞均较缓慢地增殖,但是实验组细胞增殖仍明显慢于阴性对照组细胞。培养7d内,实验组细胞的增殖趋势慢于阴性对照组,各点D值差异均有统计学意义。其中,接种第1天,实验组与阴性对照组D值比较,差异无统计学意义(t=1.197,P=0.259),从第3天开始,实验组细胞的D值均低于阴性对照组,t检验分析两者差异均有统计学意义。第3天时,t=3.564,P=0.005;第5天时,t=7.385,P=0.000;到第7天时,阴性对照组细胞D值已增至0.192,而实验组细胞D值则仅为0.143,仍低于阴性对照组,t检验分析两者差异有统计学意义(t=4.635,P=0.001)。加入DAPT后第8、10代人牙髓细胞与正常第15代细胞增殖能力的比较:从第4代细胞开始在培养基中加入DAPT,第4代细胞实验组与阴性对照组比较,两组各时间点的D值差异无统计学意义;至第8代,实验组细胞D值低于阴性对照组;至第10代,实验组细胞D值仍低于阴性对照组。将第8代实验组、第10代实验组与正常的第15代细胞的增殖曲线进行比较,结果表明第8代实验组细胞增殖曲线明显平缓,与正常第15代细胞增殖曲线极相近,几近不增殖,第10代实验组细胞增殖曲线叠加在正常第15代细胞增殖曲线上,三者的增殖曲线上各点D值相近,经检验差异均无统计学意义(图3)。第3天时,3组的D值均低于0.100水平,单因素方差分析三者差异无统计学意义(F=2.581,P=0.109);第5天时,F=0.132,P=0.877;培养至第7天时,3组细胞的D值均维持在0.200以下水平,单因素方差分析三者差异无统计学意义(F=2.753,P=0.096)。3两种信号通路的联合应用Notch信号通路是一种高度进化保守的相邻细胞间作用途径,其介导的细胞间相互作用的本质在于相邻细胞受、配体的表达不同。近年来的研究已表明在牙齿发育、牙髓损伤修复过程中也可见Notch信号通路相关基因、蛋白的表达,表明Notch信号通路可能参与牙髓细胞的迁移、增殖、分化等过程,提示Notch信号通路与牙髓组织细胞的生命过程相关。在Notch信号转导过程中,γ-分泌酶是释放NICD这一关键步骤的关键酶,应用γ-分泌酶抑制剂可有效抑制其活性,从而不能水解出NICD,阻断其激活下游基因的表达。目前研究较多的γ-分泌酶抑制剂包括IL-X(cbz-IL-CHO)、三肽γ-分泌酶抑制剂(z-Leu-leu-Nle-CHO)、二苯并氮(dibenzazepine)、DAPT、Compound等。其中,DAPT可特异性地抑制γ-分泌酶的活性,其作用机制可能是DAPT特异性作用于γ-分泌酶的核心组成部分PS1蛋白的C端,抢占PS中的Notch受体结合位点和水解位点;或者与γ-分泌酶的变构位点结合改变了γ-分泌酶的构造,从而阻止Notch受体的转移、解螺旋过程,阻断γ-分泌酶的水解作用。回顾DAPT用于机体各种细胞的Notch信号通路的研究,不同研究采用的DAPT浓度不尽相同。蔡良知等用DAPT阻断人神经干细胞的Notch信号通路,采用的浓度仅为200nmol/L。另有研究将DAPT应用于鸡胚的视网膜前体细胞,采用的浓度达到10μmol/L。而Li等将DAPT用于大鼠的间充质干细胞的浓度则为50μmol/L,这可能主要是因为研究所采用的细胞类型不同造成的。Yang等2008年的研究表明DAPT的EC50(effectiveconcentration)为1～10μmol/L,综合考虑这个浓度范围和DAPT的溶解度、细胞毒性等问题,本研究设计使用的DAPT终浓度为5μmol/L。采用此浓度的DAPT处理体外培养的人牙髓细胞,在第4代细胞即表现出了Notch信号通路下游基因Hes1基因表达显著下降,并在第8、10代实验组细胞中维持较低水平,表明DAPT可有效抑制体外培养人牙髓细胞的Notch信号通路。从第8代开始实验组细胞表达Notch信号通路下游基因的水平维持在阴性对照组的20%左右,而并不是全部阻断,这与以往的研究结果一致。可能是因为Notch信号通路除了经γ-分泌酶水解过程的经典通路外,还存在不依赖此过程的非经典通路,而DAPT只能阻断经典的Notch信号转导通路。另外,本研究设定细胞传代的比例是实验组与阴性对照组按照相同细胞数量传代接种于培养瓶中,这是因为Notch信号通路是相邻细胞间作用途径,细胞密度太低时细胞间距离大,相邻细胞的Notch配体不能与受体结合,从而影响下游通路的作用。以相同的密度接种,可以排除细胞密度对Notch信号通路的影响,后续细胞的表现是DAPT作用的效果。为了全面了解阻断人牙髓细胞Notch信号通路后,细胞中Notch信号通路相关基因表达的变化,本研究做了第10代细胞实验组和阴性对照组的Real-timePCRArray基因芯片分析。结果表明Notch信号通路下游基因Hes1和Hey1的表达显著下降,与实时荧光定量RT-PCR结果一致。NR4A2(nuclearreceptorsubfamily4,groupA,member2)也是一种Notch信号通路的下游基因,编码一种转录因子,与核受体相关因子有关。加入DAPT后,NR4A2基因表达下降,与阴性对照组的比值为0.34,也可以作为Notch信号通路被抑制的证据之一。Notch1,Jagged1、Jagged2基因是编码Notch受体、配体的基因,阻断Notch信号通路后,第10代实验组细胞的Notch1,Jagged1、Jagged2基因表达上调,可能是因为Notch受体、配体与Notch信号通路的负反馈调节造成的。这与Tranasi等观察到老年人牙髓中Notch1、Notch2基因表达下降的结果相反。分析原因,可能是因为本研究对体外培养人牙髓细胞的Notch信号通路进行抑制后,细胞内Notch信号转导受阻,细胞代偿性的上调Notch受体、配体基因的表达。PSEN2基因编码重要组成部分早老蛋白(presenilin,PS),该基因的表达上调可能是因为DAPT抢占PS中的Notch受体结合位点和水解位点或者变构位点,抑制了PS蛋白的作用,细胞负反馈上调PS基因的表达以编码产生更多的PS蛋白。本研究结果显示,经DAPT抑制Notch信号通路的牙髓细胞增殖能力显著下降。在第4代时,虽然Notch信号通路下游基因Hes1基因表达已显著下降,但此时实验组与阴性对照组细胞的增殖能力未见差异;至第8代、第10代时细胞增殖能力显现差异,可能是因为基因的表达水平在抑制剂作用后短时间内即可显现差异,而细胞的增殖作为宏观表现,需要基因调控、蛋白表达,最后才体现在细胞的增殖减慢,这个过程需要时间。将第8代、第10代实验组细胞与第15代正常传代培养的细胞比较,发现Notch信号通路抑制后第8代细胞就相当于正常第15代细胞,细胞几近不增殖,第10代细胞增殖曲线亦与以上两者叠加,提示抑制Notch信号通路后,第8代细胞就已相当于正常第15代细胞,年轻代数的细胞即可在细胞水平上提前表现出老化的特征。Notch信号通路对细胞增殖的影响可能是因为Notch信号通路的畅通与否影响着与细胞增殖相关的下游基因的表达。以往也有研究证明DAPT阻断Notch信号通路后,能够抑制大鼠脑神经干细胞的增殖。对胰腺癌细胞(BxPC-3,HPAC,PANC-1)的研究发现,位于细胞膜上的Notch1受体表达的下调可使癌细胞增殖减慢,其中处于G0-G1期的细胞数量增加,细胞周期素A(CyclinA)和D1(CyclinD1