基因育种在发酵型酵母中的应用

基因育种在发酵型酵母中的应用

发酵是啤酒发酵的灵魂和生命线，也被称为“发酵之母”。酵母的发酵性能直接影响到啤酒的品质和生产成本,它是啤酒生产的第一关键因素。对于啤酒生产来说,酵母除具有正常的生长繁殖和发酵性能以外,最重要的两点是:双乙酰和高级醇的产生量要低,这有助于提高啤酒质量、缩短发酵周期和降低生产成本,从而提高企业的竞争优势和获利能力,特别是满足低价位的广大农村市场。因此,酿酒酵母的基因育种成为我国啤酒企业紧迫而重大的战略性课题。目前企业使用的酵母主要是用传统育种获得,即根据酿酒酵母的发酵性能和啤酒的风味选育出的菌种,其性能改良程度有限。随着生物工程技术的飞速发展和酿酒酵母遗传背景的深入研究,进行定向基因育种的研究已经取得一些应用性成果。本文针对性分析和总结了酿酒酵母基因育种中双乙酰和高级醇两个主要方面的研究及其应用,以推动今后对酿酒酵母综合发酵性能的研究开发和提高啤酒行业的整体技术水平。1低醇酒母的基因育种1.1-乙酰乳酸的消除双乙酰(2,3-丁二酮)是啤酒的重要风味物质,但超过其口味阈值(普通啤酒为0.15mg/L,淡色啤酒为0.1mg/L)就会产生令人不愉快的馊饭味,因此要严格控制啤酒中双乙酰含量。由于α-乙酰乳酸经非酶促氧化脱羧生成双乙酰的速度比双乙酰还原成2,3-丁二醇的速度慢10倍左右,所以α-乙酰乳酸的消除成为控制双乙酰的限速步骤,并导致啤酒成熟时间长达5～6周。因此,基因改良菌种是从根本上实现对双乙酰生成和消除的有效控制,从而提高啤酒质量和降低生产成本。1.2双乙酰在酵母体内的还原酶作用双乙酰是酵母生长繁殖阶段缬氨酸合成途径中的α-乙酰乳酸渗透到细胞外经非酶作用氧化脱羧反应而生成。双乙酰在酵母体内可被还原酶作用生成乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)和2,3-丁二醇,或直接被α-乙酰乳酸脱羧酶作用快速生成乙偶姻,如图1所示。从图1可知降低啤酒中双乙酰含量的四种途径为:酵母直接将双乙酰还原成乙偶姻和2,3-丁二醇、降低α-乙酰乳酸生成量、提高α-乙酰乳酸转变成乙偶姻或转变成缬氨酸的量。1.3-乙酰乳酸脱羧酶基因缺失菌株的构建及回复突变率测定通过结构类似物选育低α-乙酰乳酸合成酶(AHAS)活性或双乙酰还原能力强的抗性突变株,或选育异亮氨酸和缬氨酸(Ile-和val-)营养缺陷株,达到降低双乙酰的目的。这些传统育种方法都可行,但存在降低双乙酰的程度有限和容易回复突变等缺点,所以目前主要采用基因工程方法进行育种。1.3.1构建乙酰羧酸合成酶基因缺失或AHAS活性低的工程菌。对于嘉士伯酿酒酵母(sacchromycescarsbergensis)含有乙酰羟羧合成酶基因的两种不同结构的等位基因,一种类似于酿酒酵母的ILV2基因,另一种不同于酿酒酵母基因。李艳等人采用基因工程方法取代其中的ILV2基因,即降低ILV2基因编码的AHAS酶活性,从而使α-乙酰乳酸生成量减少,同时又不至于使AHAS完全失活而变成为异亮氨酸、缬氨酸的营养缺陷型菌株,防止影响菌株的正常发酵性能。结果表明ILV2缺失的酿酒酵母发酵性能正常,而其AHAS活性降低75%,啤酒中双乙酰含量比原始菌株降低30%。1.3.2增加酵母细胞羟基乙酰同分异构还原酶基因(ILV5)的拷贝数,提高羟基乙酰同分异构还原酶(RI)活力。Dillmans等人通过增加酵母单倍体中ILV5拷贝数,使RI活力提高5～10倍,使α-乙酰乳酸快速转化成缬氨酸,并使双乙酰的峰值降低50%～60%。MithieuxS等人将ILV5在酵母中表达,此工程菌发酵的啤酒中双乙酰含量比原始菌株降低50%,而RI活力大幅度提高,有效缩短啤酒的成熟时间。比利时研究人员用ILV5取代ILV2,即达到降低AHAS酶活性,减少α-乙酰乳酸以及双乙酰的合成,同时又促进生成的α-乙酰乳酸更多地转变成缬氨酸,从而进一步降低了双乙酰的生成量。1.3.3构建α-乙酰乳酸脱羧酶基因(ALDC)的工程菌。YamanoS等人将ALDC基因整合到啤酒酵母染色体上,发酵表明可显著降低双乙酰的生成量,而工程酵母的正常发酵性能未发生改变。郭文杰、秦玉静等人都构建出含有ALDC基因的酵母工程菌,发酵实验证明可显著降低啤酒中双乙酰含量,同时又能简化发酵操作,使主发酵和后发酵时间缩短5d以上。假如采用ALDC取代ILV2,结果将即能减少α-乙酰乳酸生成,又能加速α-乙酰乳酸转变成乙偶姻,从根本上减少双乙酰的生成量。但ALDC基因都来自细菌,对工程酵母发酵生产的啤酒是否安全尚需要时间检验,但作为一种育种途径具有很高的研究价值。对使用低双乙酰工程酵母的啤酒厂,应用效果良好,但仍需配合发酵工艺等措施来有效控制双乙酰。2低醇酒和酵母的基因育种2.1高级醇的含量高级醇俗称杂醇油,是具有三个碳链以上的一价醇类,是啤酒发酵的主要副产物,包括正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇、苯乙醇等。高级醇形成了啤酒的香气和风味,并使啤酒口感柔和协调、酒体丰满圆润。啤酒中主要高级醇又有其独特的风味和相应的风味阈值,如表1所示。当高级醇含量过高时将会影响啤酒的风味和口感,饮后会“上头”而严重影响到啤酒的质量。例如啤酒中总高级醇含量超过100mg/L(下面发酵啤酒为60-90mg/L;上面发酵啤酒小于100mg/L)时会使啤酒口味和受欢迎程度明显下降。2.2发酵期间形成的发酵研究表明啤酒中80%的高级醇是在主发酵期间形成的。因此,要控制发酵过程中产生的高级醇就必须从酵母产生高级醇的途径入手,主要有以下两种途径:2.2.1氨基酸代谢的分解代谢方法也称为再谢序列，即再谢过程氨基酸酮酸醛高级醇2.2.2异戊醇的影响正常发酵中75%的高级醇来自糖代谢,25%来自氨基酸脱羧还原生成。异戊醇通常占到高级醇总量的50%,是影响最主要的高级醇。因此,需要重点研究异戊醇的生成代谢途径,如图2的糖代谢途径。2.3营养缺陷型突变株可采用选育缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等营养缺陷型或渗漏型突变株的传统育种方法,获得总高级醇降低的菌株。Rous等人对葡萄酒酵母的研究结果表明:支链氨基酸的营养缺陷型突变株比原始菌株能够减少总高级醇20%,特别是异戊醇减少达50%,而本研究室的研究也取得相似结果。但由于传统育种方法的随机性和不稳定性等问题,致使低高级醇的研究目前主要采用基因工程的方法。2.3.1eca33、eca40对异戊醇和异丁醇的影响BCAT能够切断或减弱氨基酸转变成α-酮酸的能力,从而减少缬氨酸到异丁醇、亮氨酸到异戊醇的产生,A.Eden等人研究表明异戊醇、活性戊醇和异丁醇受ecaΔ39、ecaΔ40的影响显著。Benvenisty等人研究表明缺失ecaΔ39、ecaΔ40的菌株能够显著降低异丁醇、双乙酰的含量,但对异戊醇含量的影响不显著。Dickenson等人研究证实:从缬氨酸到异丁醇的代谢途径中丙酮酸脱羧酶是合成异丁醇的关键步骤。因此,构建丙酮酸脱羧酶活性降低的工程菌能够有效降低异丁醇的产生量。2.3.2工程菌的构建通过同源重组的方法,将酵母中的YDL080c基因调出并破坏后,再转回原菌种,完成构建YDL080c基因缺失的工程菌(本研究室正在做)。此工程菌由于YDL080c基因不能合成丙酮酸脱羧异构酶,从而能够有效阻断由亮氨酸代谢分解生成的异戊醇,使啤酒中异戊醇的含量显著降低。因此,构建ecaΔ39、ecaΔ40和YDL080c基因缺失的工程菌,能够共同降低异丁醇、异戊醇含量,从而有效控制啤酒中的总高级醇。这对于提高啤酒质量,优化发酵工艺控制,甚至提高主发酵温度都具有重大意义和通用性。由于高级醇在啤酒中生成后就很难采用有效的方法消除,所以在发酵过程中要严格控制,包括从低高级醇生成菌种和发酵工艺等方面综合优化,以达到控制和降低啤酒中高级醇的目的。此外,通