内源性大麻素的疼痛调节机制解读

内源性大麻素的疼痛调节机制大麻素系统作为一种重要的神经化学系统，对其功效的探讨是近来才开始的。起初大麻素受体的发现、克隆和鉴定以及这些受体的内源性配体如anandamide和2-AG的分离证明了内源性大麻素神经调节系统的存在。后来发现大麻素受体在啮齿类的大脑中高体现(>1pmol/mg蛋白)以及大麻素受体在中枢神经系统的分布不均匀。后者是外源性大麻素介导镇痛行为效应的神经解剖学基础。集中分布在神经解剖区域如中脑导水管周边灰质（PAG），延脑头端腹内侧(RVM),和脊髓背角的大麻素受体对疼痛信号的传导和调节起作用。全部这些发现表明内源性大麻素在中枢神经系统疼痛调节信号通路中起重要作用。本文将集中叙述大麻素和内源性大麻素在棘上水平介导的疼痛调节功效。大麻素受体亚型已证明大麻素受体有CB1和CB2两种亚型，前者集中分布在大脑。相反后者在中枢神经系统神经元中浓度很低，其重要在免疫系统涉及脾、扁桃体、单核细胞、T细胞和B细胞中体现[1,2,3]。在病理性疼痛状态下，在腰段背角出现小胶质细胞活化的同时亦检测到了CB2mRNA。CB1通过Gi/o蛋白与腺苷酸环化酶呈负性耦联。这些受体的激活克制N-和P/Q-型钙离子通道并且激活钾离子和钾A内流通道。CB2也同腺苷酸环化酶负性耦联，但不与钙离子通道耦联。这些信号转导特点阐明CB1的激活通过调节钙和钾离子电传导来克制神经兴奋性和神经递质的释放。本文将叙述支持内源性大麻素在中枢神经系统通过作用于CB1受体调节疼痛的证据。有关脊柱和外周水平CB1受体的激活在调节急性和持续性疼痛中的作用，已有综述发表。近来已通过全身和局部后肢注射CB2受体选择性激动剂证明了外周CB1和CB2受体在调节急性组织损伤和急性神经损伤性疼痛中的作用。使读者感爱好的是近来有关外周大麻素镇痛机制的综述。内源性大麻素的组员及其合成大脑中某些被公认的内源性大麻素已被分离，涉及anandamide、2-AG、noladinether、virodhamine和N-arachidonoyldopamine(NADA)。其它内源性大麻素类化合物涉及有关的脂肪酸衍生物oleamide、palmitoylethanolamide和一种新的arachidonoyl氨基酸家族。这些物质缺少与大麻素受体的亲和力，但却能增进内源性大麻素的功效。我们对这些后来发现的化合物的功效还知之甚少并且这超出了本文所涉及到的范畴。由于在现在分离出的内源性大麻素中2-AG和anandamide最具代表性，故本文着重理解这些内源性大麻素在疼痛调节中的作用。Anandamide和2-AG[5,6,35]是在需要时产生（例如，由膜脂前体活性依赖性或受体刺激性分解所产生）并在产生后立刻从细胞释放。在体外anandamide的合成分两步第一步，磷脂前体N-arachidonoyl-phosphatidylethanolamine(NAPE)通过Ca2+和cAMP依赖性机制由磷脂酰乙醇胺产生，该过程由N-酰基转移酶催化。第二步，我们认为NAPE由NAPE特异性磷脂酶D水解――该酶还没有在分子水平定性――产生anandamide和phosphatidicacid的代谢中产物。在体外anandamide和CB1有优先亲和力(Ki[CB1vsCB2]=89vs371nM)，而对于vanilloidTRPV1受体anandamide只是种低亲和力的激动剂[4,5]。全身予以外源性的anandamide能够产生镇痛效应，这阐明内源性大麻素或许也能够在生理条件下镇痛。然而该效应不能较好的被选择性CB1拮抗剂SR141716A(利莫那班)所阻断，这可能是由于anandamide在体内很快被FAAH代谢成乙醇胺和花生四烯酸。体外实验表明2-AG的生成通过两种酶的持续激活。首先，通过磷脂酶C水解膜磷酸肌醇生成2-AG的前体1,2-甘油二酯(DAG)。新生的DAG随即被DAG脂肪酶（DGL）水解生成2-AG。DAG能够被DAG激酶选择性磷酸化生成磷脂酸。在脑薄片和培养细胞，2-AG的生成可能需要神经活动、膜去极化或者G蛋白耦联受体如I型亲代谢性谷氨酸盐（mGlu5）受体药理激活的刺激。2-AG是种自然存在的2-单酰基甘油，能够激活CB1和CB2受体。即使脑中2-AG的浓度是anandamide的170倍还多，但我们对内源性2-AG疼痛调节作用的认识才刚刚开始。由于大麻素受体重要作为2-AG受体起作用，我们假定2-AG是大麻素受体的真正天生配体。在甩尾实验中，全身予以外源性2-AG能够克制有害刺激诱导的应答,这表明内源性大麻素可能在生理状态下克制疼痛应答。单独予以与2-AG有关的内源性2-酰基甘油在任何实验中都体现不出故意义的活性，但它能够加强2-AG引发的行为应答。在中枢神经系统，这种“随从效应”或许在协助调节内源性大麻素的活性：通过竞争相似的水解酶可能会增强内源性大麻素的作用。内源性大麻素降解酶尽管存在催化在体2-AG水解的单酰基甘油脂肪酶，但五种被公认的内源性大麻素中的三种——anandamide、2-AG和NADA——更易被FAHH（脂肪酰胺水解酶）降解[6]。用免疫细胞化学法标记FAAH在脑中的分布。FAAH和CB1mRNA在解剖学上的对应也支持了内源性大麻素类是克制性信使的假说。近来电生理研究也证明了这一假说。故意义的是，免疫组化已证明FAAH在丘脑腹后外侧核体现，该区域正是脊髓丘脑束的终止带。这条通路是上传疼痛信号到脑的重要途径。另外，Lissauer束和脊髓背角表面神经元（如，与痛觉初级传人终止带非常靠似）的FAAH被证明是相似的。这些发现证明了内源性大麻素的灭活机制存在于中枢神经系统涉及到痛觉加工的区域，同时更进一步支持了内源性大麻素在疼痛调节中起作用的假说。即使据报道在体外FAAH降解2-AG，但似乎MGL在2-AG的灭活中起主导作用[7]。MGL作为一种丝氨酸水解酶将甘油一酯转化成脂肪酸和甘油。RNA印迹、免疫组化和原位杂交研究显示MGL在鼠脑分布不均匀，其中在皮层、丘脑、海马和小脑中水平最高。超微构造研究显示MGL即使不是唯一也是重要集中分布在轴突终末。近来，对MGL药理克制剂如URB602的更进一步研究为研究内源性2-AG在疼痛调节中的作用提供了药理工具，见下文。体外研究显示MGL的过分体现会削弱2-AG在鼠脑皮层神经元中的积聚，而不变化anandamide的积聚。另外，在Hela细胞，病毒诱导MGL的RNA沉默会伴有2-AG的基础浓度和Ca2＋刺激后浓度的明显增加。在鼠皮质纹状体和海马切片获得的培养细胞，mGlu5受体的激活会刺激2-AG（而不是anandamide）生成。该2-AG的生成是钙离子依赖性的并且能够被磷脂酶C和1,2-二酰基甘油脂肪酶水解。另外，I型mGlu受体激动剂DHPG生成2-AG能够被亲代谢性谷氨酸盐5（mGlu5）受体拮抗剂MPEP所阻断。然而，我们需要更多的研究证明在体2-AG的生成与否也经历了同样的过程。外源性2-AG的镇痛作用在FAAH（-/-）鼠中仍然存在，这阐明FAAH在体内不催化2-AG灭活。不像anandamide和oleamide,单酰甘油脂如2-AG在FAAH（+/+）和FAAH(-/-)鼠中水解活性相似。以这些发现为基础，提出FAAH是在体脂肪酰胺活性的重要调节剂而不是介质。为了更加好的评定内源性大麻素在疼痛调节中的作用，近来在运用药理学办法的同时联合使用了涉及FAAH和CB1的基因敲除办法。缺少CB1基因的突变鼠对于大麻素激动剂不能体现出典型的镇痛应答。然而，我们承认高剂量的Δ9-四氢大麻酚能够体现出非CB1依赖性的镇痛效应，尽管该效应的受体机制还不拟定。Cravatt等人继续研究FAAH基因缺少的鼠并发现这些鼠在予以外源性的anandamide后镇痛作用会加强。重要的是，这种镇痛效应的增强会被CB1选择性拮抗剂利莫那班所阻断。与FAAH(+/+)相比FAAH(-/-)鼠行为表型的出现随着着内源性脑组织anandamide的15倍增加[8]。当予以缺少FAAH鼠外源性anandamide时，它们会体现出严重的CB1依赖性行为反映，涉及运动削弱、痛觉缺失、木僵及低体温。不能合成和灭活2-AG的突变鼠的出现将会更进一步解释这些内源性大麻素在疼痛调节中的作用。大麻素受体的药理学和外源性大麻素配体对CB1竞争性拮抗剂和选择性激动剂的更进一步研究为探索大麻素在神经系统的生物功效提供了重要的药理学工具。SR141716(利莫那班)在脑中与大麻素受体有高度的亲和力(Kd=0.23nM)而与CB2(Ki[CB1vsCB2]=5.6nMvs>1μM)的亲和力非常弱[10]。利莫那班在高浓度时体现出克制vanilloidTRPV1(前VR1)受体。AM251是一种选择性、竞争性CB1拮抗剂(Ki[CB1vsCB2]=7.5nMvs>2μM)且没有vanilloid活性。有效的大麻素激动剂CP55940(Ki=0.6nMatCB1andCB2)、HU210(Ki[CB1vsCB2]=0.73vs0.22nM)和WIN55212-2(Ki[CB1vsCB2]=1.9vs0.3nM)与CB1、CB2有高亲和力并且与典型大麻素原型Δ9-四氢大麻酚(Δ9-THC)相比效能有明显改善。选择性竞争性拮抗剂和高亲和力的拮抗剂都被用来研究大麻素在痛觉信号转导中的作用和内源性大麻素的神经系统起作用的位置。对直接激活或是阻断大麻素受体的外源性化合物进行研究对于初步预计大麻素受体激活在疼痛调节中的功效是必不可少的。然而，这些研究没有提供直接的证据支持内源性大麻素在生理条件下也能发挥相似的功效。近来，对克制内源性大麻素系统酶降解药品（如，通过克制FAAH或MGL）的进一步研究使研究机体内源性系统激活所产生的效应变得更容易。URB597是一种极具特性的FAAH不可逆性克制剂(IC50=4.6nM)，与CB1和CB2受体无亲和力，同并且在浓度高于300μM时不影响MGL、乙酰基-乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶和大麻素的膜转运[9]。Arachidonoylserotonin是种新的FAAH克制剂，克制anandamide的水解(IC50=5.6μM),与CB1无亲和力,且对细胞摄取25μM的anandamide无明显影响。MGL能够被许多非选择性的丝氨酸水解酶克制剂克制（例如，甲基arachidonoylfluorophosphonate）。更近某些的研究描述了两种选择性MGL克制剂：URB602和URB754。URB602通过非竞争性机制克制鼠脑MGL(IC50=28±4μM),不影响FAAH活性和anandamide的浓度,不影响脂类代谢酶类如二酰基甘油脂(肪)酶和COX2的活性，且不影响[3H]-WIN55212-2与CB1和CB2受体的结合(IC50≥5mM)以及[35S]-GTP-g-S与鼠小脑膜的结合。URB754在疼痛调节中的作用还不清晰。即使特异性的转运体还没有被克隆，但据报道，细胞摄取anandamide的方式涉及异化扩散。Kinetics研究提出存在一种anandamide膜转运体，药理学研究通过使用anandamide转运克制剂支持了anandamide转运克制能够调节内源性大麻素的观点。这类药品中最惯用的有AM404和VDM11，前者也能够克制FAAH活性。AM404在低浓度时就能够激活TRPV1受体，而VDM11则不能。VDM11克制细胞摄取anandamide(IC50=1-11μM)却不影响FAAH,且在生物学适宜剂量时不与大麻素受体结合。近来，一种新型有效的anandamide摄取竞争性克制剂LY2318912被用来在鼠小脑放射性标记anandamide转运体的结合位点[10]。全身予以LY2318912能够使脑中anandamide水平有5倍提高。另外，LY2318912能够减少福尔马林实验中的疼痛行为，而不伴有予以直接大麻素激动剂出现的特有严重运动缺点。外源性大麻素类的镇痛效应采用不同的有害刺激（如，热、机械性和化学性）进行潜伏期行为研究证明了大麻素类能够有效的镇痛。早在1988年，Dixon指出让狗吸入燃烧大麻产生的烟能够使其对针扎不作出反映。Bicher、Mechoulam和Kosersky等人所作的大麻素镇痛研究为随即证明大麻素有效的克制急性伤害性刺激、炎症和神经损伤所致疼痛的行为反映奠定基础。大麻素在镇痛方面的效能比得上吗啡。然而大麻素造成严重的运动缺点涉及运动受限和木僵，这会影响我们行为学研究中评定有害刺激诱发的运动应答。为了弥补大麻素的这一局限性，近来许多对大麻素镇痛的研究增加了对运动受限和木僵的行为评定，这样就能够给大麻素造成的运动应答的变化提供原始对照。然而单靠行为研究还局限性以证明大麻素类能够克制痛觉信号的加工。本文从更多方面证明了大麻素类能够克制痛觉信号传导，从而为内源性大麻素镇痛机制的存在提供了强有力的证据。在急性和持久性疼痛动物模型中，通过全身予以大麻素能够有效的证明大麻素类的镇痛效应。予以天然的、合成的或外源性的大麻素所产生的镇痛效应，以及通过药理学和基因学办法不让CB1激活从而阻断前述效应，这些研究成果较好的证明了大麻素类在调节疼痛敏感性方面有着特殊的生理效应。这些研究的局限性在于不能使大麻素的效应局限在某些位点以及不能阐明是哪种内源性大麻素参加了疼痛调节。针对第一种局限性，某些研究采用区域特异性的显微注射法将大麻素类注入与疼痛信号加工和调节有关的区域。对于第二种局限性采用微量渗析和液相、气相质谱分析直接对内源性的介质作定性和定量分析，或者采用区域特异性的予以调节内源性大麻素摄取或释放的药品来作间接分析。大麻素克制痛信号传导电生理和神经化学研究为大麻素类克制在体痛信号传导提供了可靠的证据。Walker实验室首先证明了大麻素类在脊髓和丘脑能够克制有害刺激诱发疼痛神经元的神经兴奋性。在疼痛神经元观察到的这种克制，在其它多个有害刺激（机械性、热、化学性）模型普遍存在，它由大麻素受体介导并且与大麻素类的镇痛效应有关。大麻素类在正常、炎症和神经损伤的鼠亦能克制脊髓背角神经元c纤维诱发的应答。除此之外，在多个持久性痛动物模型中大麻素类通过CB1和CB2选择性机制克制脊髓中标志持续性神经兴奋的神经化学物质Fos蛋白的体现。许多电生理研究集中在脊髓背角水平的广动力范畴神经元和疼痛特异性细胞，这些研究为大麻素类克制痛信号传导提供可靠证据。脑干神经元的在体电生理研究涉及到的痛觉下调也为证明大麻素类的疼痛调节作用提供根据，我们将在下文中讨论[11,12]。在组织损伤致持续性痛模型中大麻素的镇痛效应研究证明全身予以大麻素能够对多个炎症致疼痛模型起到镇痛作用。Kosersky等人指出在后爪炎症后予以Δ9-THC能够增加爪受力致发声的阈值。Tsou等人采用福尔马林实验指出全身予以大麻素类会克制有害刺激诱发的Fos蛋白体现和疼痛有关性行为。通过福尔马林实验对棘上水平组织加工的疼痛行为进行评价。Hohmann的实验室证明脊髓下行去甲肾上腺素能投射纤维的神经毒性损害能够削弱WIN55212-2对福尔马林诱发Fos蛋白体现的克制[13]。现在已较好的证明了在组织和神经损伤造成的持续性痛模型中，外周和脊髓的大麻素镇痛位点在其镇痛中的奉献。相反，在持续性痛模型中大麻素在棘上水平的作用位点在其镇痛中的奉献却被关注的极少。在神经损伤致持续性痛模型中大麻素的镇痛效应已在某些实验性神经病变啮齿动物模型中证明大麻素类有抗痛觉过敏和抗异常疼痛作用。Bennett实验组证明了大麻素在坐骨神经慢性缩窄性损伤后的抗痛觉过敏和抗异常疼痛作用。全身予以一种CB1受体拮抗剂能够阻断上述变化。全身予以WIN55212-2能够缓和紧扎L5脊神经造成的痛觉过敏和异常疼痛；这些效应能够被CB1拮抗剂而不是CB2拮抗剂所逆转。在神经损伤鼠大麻素在重复给药后仍然有镇痛作用，这阐明大麻素在缓和神经性疼痛方面要优于阿片类。在脊神经根切断术后大量脊髓大麻素受体仍然完整，这或许有临床意义，特别是对耐受传统麻醉性镇痛药的去传人疼痛来说更由意义。因此实验研究支持大麻素类作为一种新办法治疗神经性疼痛。通过大麻素诱导的windup克制和有害刺激诱导的中枢致敏证明了在神经性疼痛中大麻素类抗疼痛过敏作用的一种可能机制。近来，通过在鼠神经病变模型采用鞘内和脑桥内注射大麻素激动剂和拮抗剂的办法证明了中枢和外周都存在大麻素抗疼痛过敏效应的作用区域。电生理研究通过紧密结扎L5/L6脊神经的办法也为证明脊髓大麻素系统含有可塑性提供根据。大麻素系统的可塑性或许可觉得大麻素治疗神经性疼痛作出奉献。然而我们对棘上大麻素镇痛位点在控制神经性疼痛中可能存在的奉献还知之甚少。网状巨核细胞parsalpha参加了大麻素对神经性疼痛的调节。将鼠坐骨神经部分结扎(Seltzer模型)，给神经损伤的对侧后肢注射福尔马林后的行为反映与无神经损伤的对照组相比要轻微。予以神经损伤鼠的网状巨核细胞parsalpha利莫那班后其对福尔马林的行为反映会增强。即使这些成果与福尔马林实验中神经损伤通过网状巨核细胞parsalpha激活CB1来介导内源性镇痛机制的假说一致，但是反激动剂效应会使解释用利莫那班评定大麻素效应变得复杂[14]。我们需要更进一步的研究以拟定与否是内源性大麻素介导了这些观察到的成果并且拟定那种特殊的内源性大麻素在镇痛效应中的生理学作用。棘上位点参加大麻素的疼痛调节最初是在评定热刺激引发的急性退缩反映的研究中报道了支持存在大麻素镇痛的棘上位点的直接证据。在甩尾实验中脊髓横断后Δ9-THC的镇痛作用会削弱，这间接证明了棘上位点在大麻素镇痛作用中起重要作用。神经电生理研究同样也证明了全身予以大麻素类对有害刺激诱发脊髓疼痛神经元反映的克制作用会在脊髓横断后削弱。在心室内予以大麻素类WIN55212-2、CP55940和D9-THC能够镇痛的研究成果直接证明了存在大麻素棘上镇痛位点。与这些行为学研究一致，心室内予以WIN55212-2后也能够在脊髓背角统计到有害刺激诱发的广动力范畴神经元应答被克制。在心室内注射[3H]WIN55212-2后采用放射自显影技术发现放射性标记药品局限在整个大脑的脑室周边。这些研究强调了脑室周边构造在大麻素介导的疼痛调节中的重要性。通过给脑干位点特异性的注入大麻素激动剂来定位大麻素镇痛的棘上位点。其它研究用甩尾实验也证明了将大麻素类显微注射在在诸如背外侧PAG、背侧脊核、RVM、杏仁核、丘脑的后外侧及submedius区域、上丘和去甲肾上腺素能的A5区都能够产生镇痛。Lichtman等人证明在腹后外侧PAG/背侧脊核附近予以CP55940也能够产生镇痛、木僵和低体温，其中与否产生低体温能够作为选择活性立体异构体的原则。相反予以尾状壳核CP55940也能够产生木僵但不会产生镇痛和低体温。在PAG背侧显微注射大麻素HU210也能够克制福尔马林诱发的CB1介导的抗伤害行为和减少PAG尾部外侧福尔马林诱发的Fos蛋白体现。PAG内注射大麻素也能够削弱PAG背角注射兴奋性氨基酸D,L-同型半胱氨酸引发的有害性防御行为(例如，运动器激活)。在鼠，外源性大麻素通过作用于背角PAG也能够调节超声诱导的伤害应答，尽管这些效应对于利莫那班的阻断作用不敏感。这些研究支持了内源性大麻素类可能是通过作用于PAG来调节疼痛和防御行为的假说。即使这些研究描述了外源性予以合成大麻素产生的上述镇痛作用位点，但是他们没有阐明是哪种内源性大麻素类在疼痛调节中起了作用。对于混合物诱导镇痛效应，研究者普通假定其中一种特殊内源性大麻素的作用。这种办法亦假定了适宜的刺激能够使这种内源性大麻素在体内释放且这种化合物的网络效应足以克制疼痛敏感性。在其它研究中研究者将内源性大麻素的浓度或释放与观察到的镇痛效果有关联。这种办法即使提供了某些信息但不能建立因果关系。带着这些想法，接下来介绍镇痛应答中特定内源性大麻素的作用。PAGPAG是产生镇痛和伤害应答的共同神经基质。电刺激PAG产生的镇痛和防御行为依赖PAG核团某些特殊部分的激活。电刺激PAG腹外侧产生的镇痛能够被阿片拮抗剂如naltrexone所阻断，这表明内源性阿片肽参加了这一过程。相反，电刺激PAG背侧和外侧核产生的镇痛却对阿片拮抗剂的阻断作用不敏感，该过程由内源性大麻素介导可被大麻素拮抗剂阻断。Walker实验组提出电刺激PAG背侧和外侧核造成大麻素受体介导的镇痛与大麻素的动员同时发生。这些作用可被全身予以或PAG内显微注射利莫那班所拮抗，这符合该反映由CB1介导。Hohmann等人近来证明了随着非阿片应激性镇痛(SIA)的体现，中脑背侧涉及整个PAG中的2-AG和anandamide浓度会升高。他们指出通过3分钟持续足电击能够产生CB1介导的非内源阿片依赖性应激性镇痛（SIA）。另外，显微注射FAAH克制剂如URB597和arachidonoylserotonin也能够增强CB1依赖性SIA。在PAG显微注射MGL克制剂URB602也能够使该区域CB1介导的应激性镇痛增强且选择性的使2-AG的浓度升高(而不是anandamide)。这些成果证明了在中脑PAG水平内源性2-AG在疼痛调节中的生理作用。内源性大麻素的作用不都是通过CB1受体介导的，因此很有必要证明内源性大麻素的作用是被选择性的大麻素拮抗剂所阻断的。有报道指出在PAG腹外侧核显微注射FAAH克制剂URB597能够使内源性大麻素的水平升高(anandamide和2-AG都涉及)，且通过CB1和TRPV1受体的激活对热伤害产生双相作用。该研究中，注射URB597产生的TRPV1介导的镇痛和CB1介导的疼痛与RVMoff-cells活性的强弱有关,这表明这些效应的产生是分别通过刺激和克制PAG兴奋性输出神经元而产生的。然而经测试用最高剂量的URB597(4nmol/rat)和WIN55212-2(25-100nmol)只会产生CB1介导的与刺激RVMoff-cells(可能是去克制)有关的镇痛。因此,可能是anandamide而不是2-AG通过选择性的作用于PAG亚区的CB1或TRPV1受体影响了疼痛调节的下行通路。体外电生理研究指出在鼠PAG，大麻素类通过CB1特异性机制在突触前克制gamma-aminobutyricacid-ergic(GA