常见食品中微生物检验-糕点、糖果检验

糕点和糖果中大肠菌群的测定大肠菌群的概念◆大肠菌群(coliformbacteria)系指一群在37℃能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。◆包括埃希氏菌属、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属

测定意义

◆大肠菌群作为粪便污染指示菌。即在食品中检出大肠菌群，不仅反映食品被粪便污染总的情况，一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况，具有广泛的卫生学意义。◆凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定其卫生学上是不合格的，该食品使用是不安全的。

大肠菌群数量的表示方法--MPN

MPN:MostProbableNumber(大肠菌群最可能数)

◆

是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。

◆三管系列：对样品进行连续10倍梯度系列稀释，选择3个连续的合适的稀释度，每个稀释度接种3管到乳糖胆盐发酵管内培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，查取大肠菌群最可能数(MPN)检索表，报告每100mL(g)检样大肠菌群的最近似数。

大肠菌群MPN的检验方法--多管发酵法

大肠菌群的检验程序稀释大肠菌群阴性革兰氏阳性伊红美蓝琼脂平板报告乳糖胆盐发酵管革兰氏阴性无芽孢检样产气乳糖发酵管不产气不产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性报告报告报告大肠菌群阴性革兰氏染色产气过程◆检样稀释◆乳糖初发酵试验（假定试验）◆分离培养◆乳糖复发酵试验（证实试验）◆报告

检样稀释

1.检样25mL(25g)放于含有225mL无菌生理盐水的三角瓶内，经充分振摇作成1:10的均匀稀释液。固体检样用无菌均质器。以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液；检样稀释2.用1mL无菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL无菌生理盐水的试管内，振荡混匀，作1:100的稀释液；3.另取1mL无菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液，每稀释一次换用1支1mL无菌吸管；

检样稀释4.根据食品卫生标准要求或对检样污染情况估计，选3个稀释度，每稀释度接种3管。

每100mL消毒乳中大肠菌群MPN不超过40个

乳糖初发酵试验◆目的：检查样品中有无发酵乳糖产酸产气的细菌。◆将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内;◆乳糖：选择作用，大肠菌群能发酵乳糖产酸产气;◆胆盐：抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌；◆溴甲酚紫：pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢杆菌生长的作用。

◆接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管；◆每一稀释度接种3管，置(36±1)℃温箱内，培养(24±2)h，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。◆如产气，按另外程序进行。

乳糖初发酵试验大肠菌群阳性反应乳糖胆盐发酵管产酸产气现象

分离培养◆将产酸产气的发酵管培养物分别划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置(36±1)℃温箱内培养18-24h，挑取典型的菌落，并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。

分离培养◆伊红美蓝琼脂平板（EMB）：伊红和美蓝染料作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，这两种染料结合成复合物，使大肠菌群产生特征性菌落：◆a深紫黑色，有金属光泽；◆b紫黑色、不带或略带金属光泽；◆c淡紫红色、中心颜色较深。伊红美蓝琼脂平板特征性菌落

乳糖复发酵试验（证实试验）◆目的：证明从乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产酸产气。乳糖复发酵试验（证实试验）◆在伊红美蓝琼脂平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-3个进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵管，置(36±1)℃温箱内培养(24±2)h，观察产气情况。乳糖复发酵试验（证实试验）◆作用机理同乳糖初发酵试验◆凡乳糖发酵管产酸产气、革兰氏染色阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；◆凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色阳性，即报告为大肠菌群阴性。◆根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN的检索表，报告每100mL(g)食品中大肠菌群的最可能数(MPN)。大肠菌群最可能数(MPN)检索表阳性管数MPN个/100mL(g)阳性管数MPN个/100mL(g)1mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×31mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×3000<30100400013010170002601021100039010315001030110700116011111001290112150013120113190020601201100219012115002212012220002315012324003090130160031130131200032160132240033190133290大肠菌群最可能数(MPN)检索表（续）阳性管数MPN个/100mL(g)阳性管数MPN个/100mL(g)1mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×31mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×32009030023020114030139020220030264020326030395021015031043021120031175021227031212002133403131600220210320930221280321150022235032221002234203232900230290330240023136033146002324403321100023353033324000说明◆本表采用3个稀释度：1mL(g)、0.1mL(g)0.01mL(g)，每稀释度3管；◆表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)、0.1mL(g)，表内数字应相应降低10倍；◆如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)0.001mL(g)，表内数字相应增加10倍；◆依此类推。糕点和糖果中菌落总数的测定相关概念1菌落总数测定的意义2菌落总数的测定3一、相关概念菌落：细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它由数以万计相同的细菌集合而成。1、菌落总数：是指食品检样经过处理，在一定条件（如培养基、培养温度和培养时间等）下培养后，所得1g或1ml检样中所细菌菌落的总数。常用菌落形成单位（CFU，colony－formingunits）表示。能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌需氧普通琼脂平板37℃48h杂菌数、需氧菌数2、细菌总数：指一定或面积的食品样品，经过适当处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。也称细菌直接镜数。通常以1g、1mL或1cm2被检样品中的细菌总数来表示。二、菌落总数测定的意义1、判断食品被污染程度的标志2、预测食品保存期限三、菌落总数的测定食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB4789.2-2010（一）范围（二）原理（三）主要设备（四）常规器皿与数量（五）培养基和试剂（六）检验程序（七）操作步骤（八）说明及注意事项（九）结果与报告三、菌落总数的测定食品菌落总数的测定菌落总数的测定高压蒸汽灭菌锅恒温培养箱冰箱放大镜或菌落计数仪恒温水浴箱均质机天平（感量0.1g）（三）主要设备（四）常规器皿与数量培养皿（直径9cm）：8个10mL无菌刻度吸管：2根1mL无菌刻度吸管：若干根250mL三角烧瓶（内置225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液，几粒玻璃珠，并事先灭菌）：1个18×180cm无菌试管（内置9mL生理盐水或磷酸盐缓冲液，并事先灭菌）：若干玻璃珠；灭菌刀；剪刀；镊子；酒精灯等平板计数琼脂培养基；75%乙醇；无菌生理盐水或无菌磷酸盐缓冲液（五）培养基和试剂（六）检验程序1、检验前准备（1）培养基、无菌器材、无菌室、超净工作台等准备（2）用酒精棉球消毒手和实验台，点燃酒精灯（3）打开锥形瓶、试管及培养皿外包扎的纸（4）在锥形瓶、试管、培养皿标注即将盛放的稀释液稀释倍数（5）合理放置器皿：培养皿按稀释倍数由低到高，从上往下放置（最上面放空白皿）（6）取一支1mL无菌移液管，以无菌方式打开，以无菌操作吸取1mL生理盐水放入“空白”培养皿，做两个平行，该移液管放置于废物筐中。（七）操作步骤2、检样稀释与加样边稀释边加样3、倾注平板及时将15~20mL冷却至46℃无菌琼脂培养基溶液（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注入培养皿内，并振动平皿，使其混合均匀。4、培养待琼脂凝固后，将平板翻转，置于（36±1）℃恒温箱内培养（48±2）h。水产品（30±1）℃培养（72±3）h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按以上条件进行培养。5、菌落计数准备检样稀释加样培养计数（八）操作说明及注意事项1、检验中所用玻璃器皿在灭菌前彻底洗净并完全灭菌。既不能存在活菌，也不能残留抑菌物质2、采样时应注意代表性，如系固体样品，取样后不应集中在一点，宜多采几个部位。3、每批稀释的检样都要有空白对照。（1）实验所使用的器皿灭菌是否彻底，储存是否合理得当。（2）无菌室的空气条件是否达到标准。（3）操作人员的无菌操作技术是否规范。4、样品稀释液多用生理盐水，有时也用磷酸缓冲液或0.1%的蛋白胨水。若检样含盐量较高（如酱制品），也可用无菌蒸馏水。5、在连续递次稀释时，为减少样品在稀释时造成的误差，每个稀释液应充分振荡或换用另一支灭菌吸管充分吹打，使其均匀。6、一支灭菌吸管只能接触一个倍数的稀释液。也即每变化一个稀释倍数时，更换一支灭菌吸管。吸管不得触及烧瓶和试管的外侧。连续稀释放液时，应使吸管内的液体沿管壁注入，勿使吸取稀释液的吸管尖端伸入稀释液内。7、琼脂含量选为1.5%。营养琼脂底部带沉淀的部分应弃去（以免与菌落混淆）。8、灭菌后，培养基应冷却到45℃后应及时进行倒平板操作，如果不能及时操作，需要将培养基放到45℃左右的恒温水浴箱中保温，以防止琼脂凝固（用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了）9、检液加入平皿后20min内倾入培养基并充分混匀，可将平皿先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转。旋转要适度，培养基不可在旋转中漏出或污染皿盖。10、皿内琼脂凝固后即要将平皿翻转后培养，这样可避免菌落蔓延生长。倒置培养原因：（1）平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，可以防止皿盖上的水珠滴落，打散菌落，在培养基表面形成菌落蔓延，产生菌苔。（2）保湿：倒置培养比正常放置培养，培养基不容易干。（3）容易手拿，不易造成污染。（4）由于重力作用，菌会向下生长，菌落形成比较大。11、不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比。若出现相反的情况，视为差错。12、当平板上有链状菌落生长时，若链状菌落之间无明显界限，则计为一个菌落；若存在几条不同来源的链，则每条链计为一个菌落；若平皿有较大片菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落平到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可计算半个平皿后乘以2，以代表全皿菌落数。（九）结果与报告1、菌落总数的计算方法2、菌落总数的报告方式例次不同稀释度平均菌落数菌落总数/[CFU/mL(g)]报告方式/[CFU/mL(g)]10－110－210－311365164201640016000或1.6×10422760295463100031000或3.1×104328633629002900或2.9×1034不可计4650513513000510000或5.1×105527115270270或2.7×1026000<1×10<107不可计305123050031000或3.1×104计算（一）菌落总数如下面几种情况，如何报告？例次不同稀释度平均菌落数菌落总数/[CFU/mL(g)]报告方式/[CFU/mL(g)]10－110－210－31142013861631551810227752853286294465232952733343624不可计不可计49214873500522529258100060000007不可计不可计302314128菌落总数如下面几种情况，如何报告？例次10-110-210-3空白127932248653563620200524400031420138616315518104糕点和糖果中常见产毒霉菌的分离与鉴定产毒霉菌极易在含糖的饼干、面包、粮食等类食品上生长，与食品卫生关系密切的霉菌大部分属于半知菌亚门中的曲霉属、青霉属和镰刀菌属。其产生的毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素、烟曲霉毒素、单端孢霉烯化合物、玉米赤霉烯酮、伏马菌素以及展青霉素、桔青霉素、黄绿青霉素等。

曲霉属：黄曲霉、赭曲霉、杂色曲霉、烟曲霉、构巢曲霉和寄生曲霉等；

青霉属：岛青霉、桔青霉、黄绿青霉、扩张青霉、圆弧青霉、皱折青霉和荨麻青霉等；

镰刀菌属：犁孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、三线镰刀菌、雪腐镰刀菌、粉红镰刀菌、禾谷镰刀菌等；

其它菌属：有绿色木霉、漆斑菌属、黑色葡萄状穗霉等。

曲霉属本属的产毒霉菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉和棕曲霉。这些霉菌的代谢产物为黄曲霉毒素、杂色曲霉素和棕曲霉毒素。1、营养菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成；无色或有明亮的颜色,一部分埋伏型,一部分气生型。2、产孢结构分生孢子梗大都无横隔,光滑、粗糙或有麻点。梗的顶端膨大形成棍棒形、椭圆形、半球形或球形的顶囊,在顶囊上生出一层或二层小梗,双层时下面一层为梗基,每个梗基上再着生两个或几个小梗。从每个小梗的顶端相继生出一串分生孢子；由顶囊、小梗以及分生孢子链构成一个头状体的结构,称为分生孢子头。分生孢子头有各种不同颜色和形状,如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。曲霉属黄曲霉构巢曲霉黄曲霉黄曲霉黑曲霉烟曲霉青霉属

本属产毒霉菌,主要包括黄绿青霉、桔青霉、圆弧青霉、展开青霉、纯绿青霉、红青霉、产紫青霉、冰岛青霉和皱褶青霉等。这些霉菌的代谢产物为黄绿青霉素、桔青霉素、圆弧偶氮酸、展青霉素、红青霉素、黄天精、环氯素和皱褶青霉素。

1、营养菌丝体呈无色、淡色或鲜明的颜色,具横隔,或为埋伏型或部分埋伏型部分气生型。气生菌丝密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。2、产孢结构

分生孢子梗由埋伏型或气生型菌丝生出,稍垂直于该菌丝(除个别种外,不象曲霉那样生有足细胞),单独直立或作某种程度的集合及至密集为一定的菌丝束,具横隔,光滑或粗糙。其先端生有扫帚状的分枝轮,称为帚状枝。帚状枝是由单轮或两次到多次分枝系统构成,对称或不对称,最后一级分枝即产生孢子的细胞,称为小梗。青霉菌镰刀菌属

本属的产毒霉菌主要包括禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、雪腐镰刀菌、三线镰刀菌、梨孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌等。这些霉菌的代谢产物为单端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮和丁烯酸内酯等。

1、营养菌丝体

气生菌丝发达高0.5～1.0cm或较低为0.3～0.5cm，或更低为0.1～0.2cm；稀疏的气生菌丝，甚至完全无气生菌丝而由基质菌丝直接生出黏孢层，内含大量的分生孢子。

2、产孢结构可产生大、小两种分生孢子。小型分生孢子通常假头状着生,较少为链状着生,或者假头状和链状着生兼有。小型分生孢子生于分枝或不分枝的分生子梗上,形状多样,卵形、梨形、椭圆形、长椭圆形、纺锤形、披针形、腊肠形、柱形、锥形、逗点形、圆形等。1～2(3)隔,通常小型分生孢子的量较大型分生孢子为多。大型分生孢子产生在菌丝的短小爪状突起上或产生在分生孢子座上,或产生在粘孢团中;大型分生孢子形态多样,镰刀形、线形、纺锤形、披针形、柱形、腊肠形、蠕虫形、鳗鱼形,弯曲、直或近于直。顶端细胞多种形态,短啄形、锥形、钩形、线形、柱形,逐渐变窄细或突然收缩。镰刀菌链格孢霉菌瓶霉菌（一）产毒霉菌的分离按GB/T4789.15-2003方法进行分离方法一稀释平板法1、检样的前处理及梯度稀释25g检样放入研钵磨碎（可先加少量无菌生理盐水）2、取10-1、10-2、10-3三个稀释度涂布平板，静置5min后倒置于温箱28-30℃培养3-5天。方法二点种法1.采样在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品250～500g，尽快检验。2.表面除菌

如为糕点样品，取糕点样品10～20g，放人灭菌的150ml三角瓶中，无菌加入无菌水超过样面1～2cm左右，塞好塞子充分振摇