凝胶电泳分离蛋白质的研究

凝胶电泳分离蛋白质的研究

对蛋白质组的研究表明，细胞的生长和分化的动态变化通过比较不同环境下细胞或组织的不同差异来观察。在正常和疾病条件下，基因启动的数量和结构的变化有助于早期发现疾病，了解疾病的发病机制，并制定适当的治疗措施。目前蛋白质组研究的主要技术手段是二维凝胶电泳、计算机图像分析和蛋白鉴定技术。蛋白鉴定方法有氨基酸序列分析、组成分析、肽质量指纹谱和肽序列标签分析等。其中肽质量指纹谱(peptidemassfingerprinting,PMF)方法鉴定蛋白质是目前蛋白质组研究较为常用的鉴定方法。由于各种蛋白质的氨基酸序列(一级结构)不同,蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异,肽混合物质量数亦具特征性,称为肽质量指纹谱(PMF),可用于蛋白质的鉴定。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)是最有效的分析肽混合物的质谱仪,肽混合物不需分离可直接分析,基质辅助激光电离方法能耐受一定浓度的盐,仪器灵敏度高,标准样品1pmol的量就足够,质量数准确度可达0.1‰～0.01‰,且操作简单,分析速度快,依仪器型号不同一次可分析十几个到几十个样品。二维凝胶电泳分离的细胞或组织蛋白,经胶上原位酶切和质谱分析得到肽质量指纹谱,用数据库检索软件将实验所得肽质量数与数据库中每种蛋白质的酶解理论肽质量数相比较来鉴定蛋白质。我们曾用标准蛋白质对这一方法进行过初步的探索。用PMF鉴定蛋白质消耗少,效率高,肽谱制备阶段可同时处理多个样品,适合大规模,高通量的蛋白质鉴定工作。研究肿瘤细胞蛋白质组,有助于肿瘤的早期发现,研究肿瘤的致病机制,开发新的治疗措施及药物。本文报道用标准蛋白质建立了肽质量指纹谱鉴定技术,并应用于鉴定二维凝胶电泳分离的人肺巨细胞癌细胞蛋白质。1材料和方法杏仁1.1表面活性剂和仪器人肺巨细胞癌PLA-801细胞株由军事医学科学院基础医学研究所陆应麟教授惠赠。30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29∶1,3.3%C)溶液、三羟甲基氨基甲烷购自Bio-Rad公司;IPG胶条购自AmershamPharmacia公司;三氟乙酸(TFA)购自Fluka公司,乙腈(ACN)购自Fisher公司;胰蛋白酶(trypsin,modified、sequencinggrade)购自Boehringer公司;α-氰基-4-羟基肉桂酸、胰岛素、胰岛素氧化B链购自Sigma公司。固相pH梯度等电聚焦仪IPGphorIEFSystem为AmershamPharmacia公司产品;垂直板电泳仪PROTENIIxiCell及附件、PDQUEST6.0二维电泳图像分析软件为Bio-Rad公司产品。TofSpecMALDI-TOF-MS为Micromass公司产品;BIFLEXIIIMALDI-TOF-MS为Bruker公司产品,具反射(reflector)和延迟提取(delayedextraction)功能。1.2方法1.2.1ipg-sds-东南角电泳人肺癌细胞株PLA-801细胞培养于含10%小牛血清培养基,收集细胞加裂解液快速冻融3～4循环,离心收集上清。用IPGphorIEFSystem进行第一向等电聚焦电泳,蛋白质上样量250μg。等电聚焦程序:12h重泡涨,其间加低电压(<50V)帮助样品进入IPG胶条;200V,1h;500V,1h;500～1000V线性上升1h;8000V,8h。聚焦完毕的IPG胶条在平衡液中平衡30min,转移到SDS均匀胶上(12.5%T,3.3%C,20cm×20cm×0.1cm),待封胶液凝固后用PROTENIIxiCell进行第二向电泳,恒流48mA,直至溴酚蓝前沿到达玻璃板底部。考马斯亮蓝G-250染色2h,脱色过夜。1.2.2tfa质谱条件的测定选取2D胶上3个蛋白斑点(图1),编号为2D-1、2D-2、2D-3,用刀片沿斑点染色边缘切下蛋白点置于样品管中。用含50%乙腈,25mmol/L碳酸氢铵溶液脱色,胶片真空离心干燥。胰蛋白酶用25mmol/L碳酸氢铵溶液配成0.01g/L溶液,加8～10μL于各样品管中,37℃保温20h。加入5%TFA溶液120μL于40℃保温1h,吸出上清,加入2.5%TFA,50%ACN溶液120μL于30℃保温1h,合并上清液冰冻干燥。加5μL0.5%TFA液溶解,混匀后质谱分析。基质:α-氰基-4-羟基肉桂酸,内标:胰岛素(Micromass公司TofSpec型MALDI-TOF-MS),外标:胰岛素氧化B链(Bruker公司BIFLEXIII型MALDI-TOF-MS)。1.2.3蛋白质序列数据库的搜索2结果和讨论显著2.1paldi-tof-ms及glu-c蛋白酶特点用标准蛋白质建立了胶上蛋白质原位酶切的方法。胶上蛋白质与酶处于不同的介质中,酶与蛋白质充分接触并发挥作用是酶解成功的关键。胶中的染料(考马斯亮蓝)和其他组分(如Tris、甘氨酸、SDS等)对以后质谱分析的影响也不容忽视。用考马斯亮蓝染色的蛋白质条带制备肽谱时,即使上胶蛋白质量达50μg,质谱分析也无结果,说明染料严重影响质谱分析灵敏度。考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue,CBB)是一种阴离子染料,与蛋白质的碱性基团结合,形成染料-蛋白质复合物。为了除去染料,经比较选用含50%ACN,25mmol/L碳酸氢铵的溶液清洗胶片,ACN可洗去蓝色染料,碳酸氢铵可保持胶的碱性环境,利于以后的酶解反应。蛋白质条带酶切前先切成细小碎片,并干燥脱水。切小的目的是增大胶与酶液的接触面积;干燥脱水是为了让胶在酶液中重泡涨,充分吸收酶液。未脱水的胶酶解液不能渗入,蛋白质与酶无法接触,实验均无结果。用于制备肽谱的酶需具以下特点:酶的水解位点专一;酶切产生的蛋白质肽段大小适合质谱分析并利于数据库检索;酶自身稳定,不易自降解。有文献报道,用PMF检索数据库时,若要提高检索准确度则产生肽谱的酶切点至少要有2个,而分子量大于5000的肽片段对检索没有很大帮助。胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶较多用于肽谱制备,胰蛋白酶水解位点在赖氨酸(K)和精氨酸(R)的羧基端,产生以K和R为C末端的肽段。一般蛋白质经胰蛋白酶水解后多产生平均质量数1000～3000的肽段。MALDI-TOF-MS适宜测量质量数在500以上的分子(在几kD以内质量准确度较高),所以胰蛋白酶酶切产生的片段适于质谱分析。Glu-C也适用于肽谱制备,但其价格较昂贵,本实验室较少使用。我们使用Boehringer公司提供的修饰过的测序级胰蛋白酶,此酶分子中连接了多聚物,减少了酶的自降解。2.2tkis-大力发现并进行了分子质量鉴定的过程数据库检索程序根据输入的蛋白质等电点、分子量范围及肽指纹谱数据和其他一些参数在数据库中寻找与这些参数相匹配的蛋白质。人肺巨细胞癌细胞株的细胞蛋白质双向电泳分离谱图如图1所示,取胶上3个蛋白质斑点制备肽质量指纹谱(图2～图4),数据库检索参数如表1所示。点2D-1的检索结果如表2所示,在设定的参数范围内,MS-Fit检索到一种蛋白质,鉴定斑点2D-1可能为甘油醛-3磷酸脱氢酶2(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,G3P2),肽段的序列覆盖率为51%。点2D-2的检索结果如表3所示,在设定的参数范围内,PeptIdent检索到一种蛋白质,鉴定斑点2D-2可能为遍在蛋白羧基末端水解同工酶(ubiquitincarboxyl-terminalhydrolaseisozyme,UBL1),肽段的序列覆盖率为54.3%。点2D-3检索结果如表4所示,在设定的参数范围内,PeptIdent检索到7种蛋白质,前6种均为磷酸丙糖异构酶(triosephosphateisomerase,TPIS),差别在于蛋白质的种属不同。从结果列表中可看出不同物种的此蛋白质序列同源性,得分值由高到低分别为人、猕猴、兔、大鼠、小鼠、鸡的TPIS,表现出了进化树的趋势。TPIS-HUMAN的肽谱与实验测定结果最吻合,得分最高,且已知实验所用细胞为人肺细胞,故可鉴定蛋白斑点2D-3为人丙糖磷酸异构酶,序列覆盖率66.9%。蛋白2D-3的肽谱实验值与TPIS-HUMAN理论值的比较见表5:在二维电泳数据库SWISS-2DPAGE中检索蛋白质TPIS-HUMAN,发现在已登录的15种人细胞/组织的蛋白质二维电泳图谱中,有8种细胞/组织的蛋白质电泳图谱中鉴定出了此蛋白质,鉴定方式大部分为图谱比较和测序、氨基酸分析。1999年1月登录的结肠腺癌细胞二维电泳谱中的TPIS-HUMAN蛋白斑点的鉴定使用了PMF方法,肽片段序列覆盖率为63.3%,与我们的结果相近。从2D图中看出,点2D-2与2D-3的表观分子量与其理论分子量不符,这可能是由于蛋白质不规则的电泳行为造成。许多蛋白质在SDS电泳中表现出的分子量与实际分子量都有偏差,某些无翻译后修饰的小蛋白质的分子量误差可达30%。用PMF法鉴定蛋白质的成功离不开质谱技术的发展,仪器所测肽质量数越精确,检索结果越可靠。新一代的MALDI-TOF-MS分析肽混合物可达fmol的灵敏度和万分之一的质量精确度。这从技术上推进了蛋白质组的研究,使PMF方法鉴定蛋白质成为蛋白质组研究中大规模鉴定的首选方法。在SWISS-2DPAGE库中,以往登录的蛋白质鉴定手段大部分是谱图比较、免疫印迹、测序和氨基酸组成分析,很少用到质谱技术。而1999年1月登录的人结肠腺癌细胞二维电泳谱图中,10