酵母甘露寡糖对肉仔鸡肠道微生物、短链脂肪酸及免疫机能的影响

酵母甘露寡糖对肉仔鸡肠道微生物、短链脂肪酸及免疫机能的影响

甘草糖是指甘草糖或甘草糖与葡萄糖通过i-1、2、i-1、3、i-1、6或iii-1、3和iv-1的四糖苷组的苦聚糖，通常是从爷爷的粗粉、甜味橡胶和微生物培养基中提取的。甘露寡糖进入消化道后不能被消化酶所降解,到达后段肠道后发酵产生短链脂肪酸,降低pH值,抑制有害菌生长,还可以吸附致病菌改善肠道健康,通过提高免疫球蛋白水平,改善巨噬细胞活性等提高机体免疫力,增强抗病性。日粮中添加0.3%(质量分数w,下同。)的MOS可以降低仔猪盲肠内大肠杆菌数量,促进双歧杆菌和乳酸杆菌生长,提高仔猪日增重和饲料报酬。口服或皮下注射MOS可以提高雏鸡免疫器官重量,饲料中添加MOS可增强蛋鸡白细胞吞噬能力、PHA淋巴细胞转化率和T淋巴细胞比例,显著提高肉鸡体内抗体反应等。魔芋作为甘露寡糖的主要来源,目前已开发出纯度较高的保健品魔芋甘露寡糖,而目前市场上为数不多的寡糖类产品寡糖纯度只在35%～55%,而且因含单糖和淀粉类物质而难于保存,同时我国也是啤酒酵母生产大国,废弃的啤酒酵母细胞壁中同样含有丰富的甘露寡糖,因此从啤酒酵母中提取高纯度的甘露寡糖及其实际应用效果已经成为近几年的研究热点。本实验室通过酶法和酸法结合有机溶剂的方法制备出高纯度的甘露寡糖,但其在肉鸡上的应用效果还有待验证。因此,本试验旨在探讨实验室自行提取的啤酒酵母甘露寡糖在肉仔鸡日粮中的实际应用效果。1材料和方法1.1分子质量及纯化啤酒酵母甘露寡糖:本实验室从啤酒酵母细胞壁中提取,可溶于水,分子质量约为3kD,键型主要以α-1,6为主链连接形式,以α-1,2或α-1,3为支链连接形式,纯化率达90%。魔芋甘露寡糖:由成都协力植物加工园购得,纯化率达95%。1.2基础日粮添加量对产品稳定性的影响选用1日龄AA商品肉仔鸡公雏300只,随机分为5个处理,分别为基础日粮组(对照组)(表1),基础日粮添加0.05%、0.1%和0.15%甘露寡糖组和添加0.1%魔芋甘露寡糖组,各处理组通过减少沸石粉的用量保证配方有效成分含量的一致性。每处理4个重复,每个重复15只鸡。1.3饲养管理方法试验采用稻壳作为垫料进行地面平养,人工喂料,乳头饮水器供水,肉鸡饲养管理按常规饲养方法进行。于7、21日龄进行新城疫一免和二免,14日龄进行法氏囊免疫。1.4脂肪酸和氨基酸指标1)肠道微生物测定。试验于21和28日龄每个处理取8只鸡,在无菌条件下取全部盲肠,分别用于乳酸菌和双歧杆菌,大肠杆菌和沙门氏菌测定。2)盲肠短链脂肪酸(SCFA)的测定。试验于21日龄每个处理取8只鸡,取盲肠内容物,用蒸馏水稀释后,离心取上清液,利用酸化法进行去蛋白处理后用气相色谱法测定盲肠食糜中短链脂肪酸含量。3)血清新城疫HI抗体效价的测定。于14、21、28、35和42日龄每个处理8只鸡进行翅下静脉采血,分离血清,采用红细胞凝集抑制试验测定血清中新城疫HI抗体效价。4)外周血T、B淋巴细胞转化率及巨噬细胞吞噬指数的测定。于21和42日龄每个处理随机取8只鸡,翅静脉无菌采集抗凝血5mL(肝素锂无菌真空采血管),采用淋巴细胞体外培养和MTT(四甲基偶氮唑盐)法测定T、B淋巴细胞转化率。结果以刺激指数(SI)表示:SI=ConA(或LPS)刺激的D570nm/对照管的D570nm。采用淋巴细胞体外培养和中性红法测定巨噬细胞吞噬指数(D540nm)。5)盲肠食糜sIgA含量的测定。于28日龄,每个处理8只鸡,在无菌条件收集盲肠食糜,用生理盐水稀释后,离心取上清液,采用试剂盒法测定sIgA的含量(所用试剂盒购自美国Bethyl公司)。1.5数据处理与统计分析数据采用SPSS13.0统计软件中One-wayANOVA进行方差分析,差异显著性进行Duncan氏多重比较。2结果2.1啤酒酵母模拟添加1d盲肠内双歧杆菌数量添加啤酒酵母甘露寡糖对试验肉鸡21日龄盲肠内乳酸菌数量作用不明显(表2),魔芋甘露寡糖显著增加了乳酸菌数(P<0.05)。啤酒酵母甘露寡糖可以增加21d盲肠内双歧杆菌的数量,其中0.05%和0.10%啤酒酵母甘露寡糖组与空白对照组和魔芋甘露寡糖组相比差异极显著(P<0.01)。与空白对照组相比添加3个不同剂量的啤酒酵母甘露寡糖极显著减少了28d盲肠内大肠杆菌和沙门氏菌数量(P<0.01),并且以0.15%高剂量组的效果最好。魔芋甘露寡糖也可以减少大肠杆菌(P<0.05)和沙门氏菌(P<0.01)的数量,但与魔芋甘露寡糖相比,啤酒酵母甘露寡糖对大肠杆菌有更好的抑制效果(P<0.05)。2.2啤酒酵母甘露寡糖对小鼠体内脂肪酸含量的影响由表3可知,添加啤酒酵母甘露寡糖后盲肠内的异丁酸、丁酸和戊酸含量均低于对照组,其中0.05%和0.10%啤酒酵母甘露寡糖组异丁酸含量与对照组相比差异显著(P<0.05),0.05%组的戊酸含量显著低于对照组(P<0.05),与对照组和魔芋甘露寡糖组相比,添加啤酒酵母甘露寡糖可提高乙酸、丙酸和总短链脂肪酸的含量(P>0.05)。2.3魔芋甘露寡糖组p>0.05添加0.05%酵母甘露寡糖的抗体效价显著的高于一免后14d对照组和魔芋甘露寡糖组(P<0.05)。添加0.10%和0.15%的酵母甘露寡糖与对照组相比显著提高了二免后14d的抗体效价(P<0.05),且以高剂量组的效果最好(表4)。2.4提高细胞对cha的反应性不同处理对试验第42天的淋巴细胞LPS刺激指数无显著差异。与对照组和魔芋甘露寡糖组相比,添加0.10%啤酒酵母甘露寡糖显著提高了淋巴细胞对ConA的反应性(P<0.05)。添加0.05%(P<0.01)和0.10%(P<0.05)啤酒酵母甘露寡糖的巨噬细胞吞噬指数显著高于对照组,同时0.05%组的巨噬细胞吞噬指数也高于魔芋甘露寡糖组(P<0.01)(表5)。2.5对啤酒酵母的siga含量影响试验第28天的盲肠内sIgA含量以魔芋甘露寡糖组最高,3个不同剂量的啤酒酵母甘露寡糖组sIgA含量依次呈下降趋势,与对照组或魔芋甘露寡糖组相比无显著差异(表5)。3讨论3.1以酵母为原料的回复突变试验动物肠道内的微生物区系很容易被日粮成分所影响,尤其是受日粮中糖类物质的影响。早在20年前就已证实非可消化性多糖如,果寡糖、甘露寡糖和半乳甘露寡糖等对人体肠道菌群可产生有益影响。动物试验表明,添加低剂量的果寡糖(0.1%)可以减少肉鸡肠道中沙门氏菌数量,同时果寡糖还可以作为某些肠道有益菌的发酵底物促进其生长等。也有研究表明,甘露寡糖具有这种功能。本试验中,啤酒酵母甘露寡糖对双歧杆菌有促生长作用,其中0.05%和0.10%啤酒酵母甘露寡糖组与对照组相比差异极显著(P<0.01)。有研究指出添加1g/kg的甘露寡糖可以显著提高岭南黄鸡盲肠中的双歧杆菌数量,与本试验结果一致。这说明甘露寡糖可以作为双歧杆菌的促生长因子,而也有研究指出,寡糖类物质可以被双歧杆菌利用代谢产乳酸和乙酸,除此以外,双歧杆菌的增殖还可以分泌更多杀菌或抑菌类物质从而抑制沙门氏菌属、弯曲菌属、志贺菌属等。乳酸菌也是有益菌的代表之一,本试验中酵母甘露寡糖组的乳酸菌数量要高于对照组,但差异不显著。小剂量的甘露寡糖在仔猪日粮中添加可以显著提高其盲肠内的乳酸杆菌含量。而0.1%、0.4%、1.0%不同剂量的甘露寡糖在火鸡前期日粮中添加对盲肠乳酸杆菌的数量并无显著影响,同时在国内肉鸡试验中也有相似结论。因此,甘露寡糖对乳酸菌是否有增殖效果,其能否被乳酸菌利用还有待进一步研究。肠道致病菌可导致疾病传播、影响生产性能。在本试验中0.05%、0.10%和0.15%剂量的啤酒酵母甘露寡糖极显著的减少了盲肠内大肠杆菌和沙门氏菌的数量(P<0.01)。除了甘露寡糖可促进某些有益菌增殖对有害菌产生抑制作用以外,也可能由于甘露寡糖可以替代肠上皮的甘露糖型受体蛋白与含有Ⅰ型菌毛的致病菌相结合,并将其清除肠道。同时许多体外试验也表明甘露寡糖可以吸附多种拥有Ⅰ型菌毛的病原菌,包括,大肠埃希氏菌和沙门氏菌等。本次试验所用的酵母甘露寡糖主要以α-1,6为主链连接形式,以α-1,2或α-1,3为支链连接形式,有研究指出α-1,3到α-1,6分支的结构与致病菌上甘露糖型的外源凝集素具有高度的亲和力,从而对某些致病菌的抑制效果更好。本试验中3个剂量啤酒酵母甘露寡糖组的乙酸、丙酸以及总挥发性脂肪酸含量均高于对照组(P>0.05),而肠道内短链脂肪酸具有降低氧化还原电位,影响有害菌生长和代谢所必需辅酶的氧化还原作用,从而抑制致病菌,这可能也是导致肠道内大肠杆菌和沙门氏菌数量减少的原因之一。3.2啤酒酵母回复突变对大鼠肠道免疫的影响甘露糖可以和肠相关淋巴组织上的某些防御细胞上的受体相结合从而激活免疫防御机制如,促进淋巴细胞增殖、增强吞噬作用等。有报道指出甘露寡糖对仔猪的细胞免疫和体液免疫有刺激作用,蛋鸡日粮中添加2g/kg的甘露寡糖可以极显著提高白细胞吞噬率和PHA淋巴细胞转化率。此次试验中,0.1%的啤酒酵母甘露寡糖组显著提高了ConA对T细胞的刺激指数,说明一定剂量的啤酒酵母甘露寡糖可以激活由T细胞介导的细胞免疫防御机制。有研究指出添加0.1%的甘露寡糖可以极显著的提高血液中T淋巴细胞的百分率,这与本试验结果相似。而高水平的巨噬细胞吞噬指数表明吞噬细胞处于较高活化状态以及抗原递呈作用的增强,从而增强机体的非特异性防御机能。本试验中,添加0.05%和0.10%啤酒酵母甘露寡糖与对照组相比均提高了巨噬细胞的吞噬指数。这可能是由于一小部分的甘露寡糖通过肠黏膜上皮M细胞被转运到肠集合淋巴节(payer’spatches,PP)等肠相关淋巴组织从而激活巨噬细胞发挥免疫功效。本试验,在新城疫一免后14d和二免后14d啤酒酵母甘露寡糖有提高新城疫抗体效价的作用,证明甘露寡糖可以提高针对新城疫病毒的特异性抗体水平,这与Cotter在肉鸡上的研究结果基本一致。但也有研究指出,肉鸡日粮中添加甘露寡糖对提高法氏囊和新城疫的抗体效价没有明显的作用。sIgA可以防止细菌黏附到黏膜细胞,防止内毒素或微生物与微绒毛结合,是构成肠黏膜免疫屏障的重要组成部分。国外曾有研究指出甘露寡糖可以提高火鸡肠黏膜sIgA水平以及血液中的IgG含量,这可能也是甘露寡糖与肠黏膜淋巴细胞特异性受体结合刺激了B淋巴细胞分泌免疫球蛋白。在对鼠的肠道免疫中也发现,葡甘露聚糖,水溶性魔芋甘露聚糖可调节肠道内sIgA