膜片钳技术在心血管药理学中的应用

膜片钳技术在心血管药理学中的应用

膜片移植技术是利用分子水平了解生物膜离子通道门的动态特征、渗透性、选择性和其他膜信息，提供最直接的方法，使人们对膜通道功能的理解进入一个新的水平，也是心血管研究方法的创新进步。1976年，neher和sakman首次报告了膜片移植技术对单个膜块的电流进行了记录。在过去的20年里，该技术被广泛使用，促进了细胞和细胞膜的发展。心血管的研究也离不开膜片移植技术。其特点和基本原则与经典微电极技术相似，但记录了不同的膜离子流，它们是以四种形式记录的。例如，将细胞吸附在一起，外部瓣膜记录，外部瓣膜记录和全细胞计数结构。膜片夹技术的发展和应用，使人们对心血管药理学的研究更加深入，对疾病和药物的作用认识不断更新，在疾病、病因和药理学方面提出了许多新观点。本文主要介绍了膜片移植在心血管药理学研究中的应用。1膜片移植技术在心血管药理学研究中的应用1.1u3000kispt-pcr的抗心肌缺血作用自1983年在心肌细胞膜上首次发现ATP敏感的钾通道(KATP)以来,KATP在心肌缺血损伤的病理生理机制中的作用越来越引起了人们的关注.实验证明在生理条件下,心肌细胞内的ATP浓度为毫摩尔水平,这一浓度能明显抑制KATP通道.ATP/ADP比率轻度变化时,只有为数很少的KATP通道开放.因此,在生理条件下KATP通道未必起作用.但在缺血和其他代谢抑制的情况下,KATP通道即被明显激活.据李翠兰等首次直接观察到心肌缺血预适应(IPC)可导致KATP通道在预适应末及随后长时间缺血早期的适度激活,但不影响长时间缺血晚期和再灌注过程中的开放程度,为进一步研究IPC的发生机制预先给予格列苯脲可加重缺血再灌注损伤,然而,急性心肌缺血时KATP通道激活所致的细胞外钾堆积是诱发严重室性心律失常的主要原因.因此,KATP通道激活也有其不利的方面.彭俊等试验表明,二乙酰基莲心碱可浓度依赖性阻滞兔心室肌细胞的瞬时外向钾电流和内向整流钾电流.马玉萍等试验表明,多非替利衍生物CPU86017对分离的单个豚鼠心室肌细胞缓慢激活(Iks)具有浓度、时间依赖性和电压依赖性阻断作用.王志勇等试验表明,瞬时外向电流(Ito)及内向整流钾电流(Ik1)是参与心脏动作电位复极化的主要膜电流,槲寄生黄酮苷抑制Ito和Ik1的内向成分影响动作电位复极过程,可使心肌复极化过程减慢,动作电位时程延长,进而延长有效不应期,是其抗心律失常作用的重要机制.1.2对l-型钙通道的抑制作用哺乳动物心肌细胞膜去极化时,细胞外液Ca2+由钙通道进入细胞内,启动细胞兴奋收缩耦联.由于Ca2+通过钙通道内流是细胞兴奋收缩耦联的首要条件,因此研究Ca2+和钙通道及其调控为进一步阐明兴奋收缩耦联机制具有重要意义.钱卫民等试验观察到丹参素能使豚鼠心室肌细胞L-型钙通道电流-电压曲线明显上移,不改变激活和反转电位,对不同电压最大激活钙电流的稳定激活和失活曲线也无影响.丹参素对L-型钙通道电流具有明显的阻断作用,具有类似异搏停样L-型钙通道阻断剂作用.谢世荣等试验结果表明,甘草次酸通过阻滞心室肌细胞膜L-型钙通道抑制钙离子内流,这种机制可能与甘草次酸抗心律失常作用有关.1.3膜片钳在心肌生理及病理生理中的应用膜片钳技术的一大优点就是在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物或毒素,研究它们对通道功能的可能影响.通过研究,一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机理;另一方面,分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点,提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息.近十年来心血管药物学研究重要的成就就是各种药物对心血管的影响.首先是各类抑制心肌L-型离子通道的药物(如丹参素、甘草次酸、大豆肽、大蒜素、CPU86017、多非替利衍生物CPU228);其次是导致心律失常的因素(如血小板活化因子、缺氧);赵新然等试验证明溴苄基四氢小檗碱对正常豚鼠心室肌细胞钾电流(IK)及L-型钙电流ICa-L均有阻断作用,这种多离子通道的阻断剂可有效抗快速心律失常,并且不会引起动作电位时程和有效不应期的过度延长,从而减少药物的致心律失常作用;再次是保护心肌、抗心肌缺血和心肌梗死的药物(如三七、丹参、当归、人参、连心碱)、中药钙激动剂红花黄素和钱子碱.侯炳军发现微量元素对心肌细胞有保护作用.1.3.1与药物作用有关的心肌离子通道心肌细胞通过各种离子通道对膜电位和动作电位稳态的维持而保持正常的功能.近年来,学者们在人类心肌细胞离子通道特性的研究中取得了很多进展,使得心肌药理学实验由动物细胞模型转向人心肌细胞成为可能.目前利用膜片钳技术的实验研究所涉及的主要离子通道有以下4种.1.3.1.1快钠通道(INa)快钠通道能够去极化,传播动作电位,对维持细胞兴奋性及正常生理功能有主要作用.邓春玉等试验证明,卡维地洛能够抑制心肌细胞钠通道电流,呈浓度依赖性和频率依赖性.邓春玉等试验证明,葛根素能浓度依赖性地增加心肌钠通道电流.欧阳平等证明,新型重组海葵毒素hk2a对大鼠心室肌细胞钠通道的时间依赖性失活的减慢,是hk2a对心脏具有正性肌力效应的重要机制.1.3.1.2钙通道心肌的兴奋与收缩与心肌细胞钙离子通道密切相关.目前膜片钳技术已在心肌细胞上记录到L、T和B型电压依赖性钙通道上.L-型通道目前研究得最多,心肌以持久开放、失活缓慢占优势,具有电压、时间依赖性.单通道电导较大,激活电压T型是正40mV左右.T型通道开放时间较短,单通道电导小,多在阶跃命令早期开放,膜电位-50mV时失活,T型电流不易记录.B型通道有自发开放和明显电压依赖性特点.荆玉红等证明,鹌鹑心室肌细胞上存在着L-型钙电流,此电流为构成鹌鹑心室肌细胞动作电位的重要电流之一.邓春玉等试验表明,H2O2可以增加大鼠心肌细胞Ica-L,且使其失活明显减慢.单宏丽等证明,预先应用红花黄素对H2O2损伤有一定的拮抗作用,说明其能够清除氧自由基,为临床应用治疗缺血性心脏病提供理论依据.邓春玉等证明,氯胺酮对心肌细胞膜L-型钙通道具有抑制作用,其抑制程度有浓度依赖性.张斌等证明,三七皂甙单体Rg1对L-型钙通道无抑制作用.1.3.1.3钾通道钾通道种类最多,它通过调节膜电位而降低组织兴奋性,阻抗去极化,影响动作电位的频率及时程,因而能够在不同的时程和电位水平精确调控细胞静息膜电位和动作电位.目前已经能够根据不同的通道敏感阻断药物和各自不同的激活/失活电位进行鉴别和区分.主要有:①内向整流钾电流(inwardrectifierpotassiumcurrent,IK1),因其内向整流特性而得名,又称背景钾电流.在维持静息膜电位和快速复极过程中有主要作用.有时间依赖性激活和失活特点.IK1在超极化时激活,激活的电压范围随胞外钾浓度变化而变化,表现为纯的K+内流.Koumi等注意到人心室细胞通道IK1的密度及电流幅度均大于心房细胞,并发现IK1的变特点在扩张性和缺血性病变的心室肌细胞间有明显不同.②延迟整流钾电流(delayedrectifierpotassiumcurrent,Ik)是心肌细胞去极化时激活的外向钾电流,其激活有电压和时间依赖性,是3期复极的主要离子流.目前根据分子生物学及通道动力学差异分为3种类型,即延迟整流快成分rapidIK,IKr,延迟整流慢成分(slowIK,IKs)和人心房肌延迟整流超速激活型成分(ultra-rapiddelayedrectifierK+current,IKr).而IKs和IKr均可成为抗心律失常药的靶位.瞬间外向钾电流(transientoutwardpotassiumcurrent,Ito)在去极化早期出现,为动作电位的早期复极化电流.其特点在人及动物心肌细胞依种属、组织而有差异,但均有电压依赖性快速激活和迅速灭活的特点.Ito又分为2种成分:Ito1为电压依赖性,对钾通道阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)敏感.Ito2对4-AP相对不敏感.刘玉梅等试验证明,甲醇降低动作电位幅度,缩短动作电位时程,影响心肌正常工作,可能与它对心肌细胞钾通道的作用有关.黄爱杰等证明,利多卡因可以明显阻滞大鼠心室肌的瞬时外向钾电流.刘玉梅等证明,延胡索乙素抗心律失常作用机制可能与它对心肌细胞钾通道作用有关,延胡索乙素可抑制Ik和Ik1,使动作电位时程(APD)和有效不应期(ERP)延长从而发挥其抗心律失常作用.吴辉等试验证明,心肌肽素抑制豚鼠心室肌细胞Ik1,可能是其抗心律失常作用的机理之一.1.3.1.4其它通道其它通道与心肌电生理、药理、病理生理关系密切的还有Na+-Ca2+交换电流、Na+-K+泵电流、细胞质膜钙ATP酶和肌浆网Ca2+泵、氯离子通道、第二信使门控钙通道(second-messenger-operatedCa2+channels,SMOCs)及配体依赖性通道等其它通道类型,共同决定着心肌细胞的功能状态.随着膜片钳技术的不断完善,可能会新发现更多的离子通道类型,并阐明其结构与功能.膜片钳技术以其实用、快速、灵敏、准确及重复性好等技术优势已经在大量的研究中得到证实.这一技术发明至今已有20多年历史,国外20世纪80年代中期用此技术进行研究并推广,国内20世纪90年代初引进这一技术.但国内目前由于多种原因用此技术进行心血管药物与心肌细胞离子通道的研究多停留在动物细胞阶段.种属及组织差异使得实验数据与临床的联系上还有一段距离,亟待采用同种动物细胞进行大量的研究,这也是今后药物研究的一个热点领域.2003年JoseJalife等在关于(人)VF分子机理的认识的文章中叙述,对豚鼠VF模型的光谱分析数据和计算机模拟显示,左心室(LV)与右心室(RV)细胞中内向整流钾通道电流(IK1)的浓度差是VF的原因.电压闸门、河豚毒素敏感性钠电流(INa)在螺旋波折返的稳定中起到了主要作用.螺旋波折返的稳定是VF等心律失常的生物电基础.二氢蝶啶敏感性钙电流(ICa)阻滞可将VF转换为室性心动过速(VT).心脏中存在着一些对折返性心律失常敏感的心肌组织.这些敏感的心肌组织与不敏感的心肌组织生物电的差异,是导致VF的原因.而正常的心肌生物电是Na1+、K1+、Ca2+等离子跨膜转运形成的,因此,不同部位心肌细胞跨膜离子转运的差异是形成VF等心律失常的基础.最近一些学者的研究结果表明