原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用

原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用

20世纪60年代，原生质体融合（proto癌）技术始于20世纪60年代。1960年法国Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年,匈牙利Ferenczy报道了白地霉(Geotrichumcandidum)的营养缺陷型突变株的原生质体的融合。原生质体融合育种已从微生物种内融合扩展到界间的融合(如光合细菌与酵母菌的融合)。1979年匈牙利的Pesti首先报道融合育种提高青霉素产量,原生质体融合技术成为改良工业菌株的手段之一。本文综述原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用。1种间原生质体融合对农抗穿刺活性的影响利用原生质体融合技术不但可用于提高抗生素产量,同时还可用于融合子产生新的抗生素的研究,特别是在链霉菌育种中。贺敏霞等通过诺卡氏菌原生质体融合重组研究发现3株融合子产生亲本没有的抗生物质,还得到1株甾体转化活力明显高于亲本的融合子。林荣团等以天然无抗菌活性的变青链霉菌1326与链霉菌1254营养缺陷型突变株进行种间原生质体融合,筛选到5株抗菌活性较稳定的融合菌株。曾洪梅等通过原生质体融合的方法提高了农抗武夷菌素的效价。陈五岭等通过比较He-Ne激光和聚乙二醇(PEG)对红霉素链霉菌(SE)和龟裂链霉菌(SR)灭活原生质体的诱导融合,筛选得到几株红霉素产量与亲本相比有明显差异的融合子,产抗生素能力与亲本的相比,最多提高了28.04%。王金盛等以小诺霉素(Micronomicin,MCR)产生菌棘孢小单胞菌(Micromonsporaechinospora)为出发菌株,通过单亲致死原生质体融合,以链霉素为选择条件选出融合株,筛得4株MCR百分含量高于亲株的融合子。2原生质体融合技术庞小燕等以酒精酵母和热带假丝酵母为亲本,通过原生质体融合技术,获得了既具有糖化酶活性又能高产酒精的稳定的酵母融合株,酒精发酵产量可达8.8%和11.5%。高年发等将酿酒酵母与粟酒裂殖酵母进行属间原生质体融合选育到降解苹果酸强的菌株。高玉荣利用发酵力强的葡萄酒酵母与降酸能力强,发酵性能好的粟酒裂殖酵母融合,获得的融合子酵母具有:(1)安全性能好,稳定性强;(2)单菌株发酵,易管理,操作简单稳定;(3)生产产品口味好,口感稳定,用原生质体融合技术的培养选育出的优良菌株降酸率可达30.4%,比葡萄酒酵母的降酸性提高20%。Kumari等将能够分解纤维素的TrichodermareeseiQM9414和从葡萄糖产酒精的SaccharomycescerevisiaeNCIM3288进行融合,得到2株(M14和M62)具有很强的将滤纸纤维素转化为酒精的能力。赵华等成功地对酒精酵母(K酵母)和产酯酵母(F2)进行了属间细胞融合,得到既具有酒精酵母的高产酒特性,又具有产酯酵母的高产酯特性的发酵性能稳定的融合子。杜连祥等进行糖化酵母单倍体H-3(2)-2菌株与优良嗜杀啤酒酵母5-24菌株的原生质体细胞融合,将糖化酵母的糖化酶基因转移到嗜杀啤酒酵母中,获得1株高发酵度嗜杀啤酒酵母F-35-88菌株。啤酒酵母(S.cerevisiae)凝集性良好,可使啤酒发酵液澄清速度加快,降低分离酵母时的能量还可防止酵母细胞自溶而影响啤酒风味。啤酒酵母的凝集特性由其本身的遗传特性决定。一般凝集性较好的啤酒酵母往往发酵度偏低。陈海昌等应用原生质体融合技术选育出的融合子FP19,既具有较高的发酵度又具有较强的凝集性。许多种微生物能在45-65℃生存,有的甚至更高。微生物耐热性的机理还不很清楚,但其耐热性却有重要的价值。在酒精酿造中,酿酒酵母于40℃时产酒明显下降。为此必需消耗大量能源降低发酵液的温度。文铁桥等通过PEG诱导碘乙酸灭活呼吸缺陷克鲁维酵母原生质体与酿酒酵母原生质体融合,获得45℃发酵产酒率高达8.7%的高温酵母菌株AY006。3原生质体融合技术通过原生质体融合技术使两个菌株的遗传物质得到重组,从而建得兼具两个亲本优良性状的新菌株。张清文等以多糖产生菌T和胡萝卜素产生菌C1-B为双亲,用原生质体融合技术选育出了1株既产多糖又产胡萝卜素的杂交品系。韦革宏等将RhizobiumleguminosoumUSDA2370和SinorhizobiumxinjiangnesisCCBAU110进行原生质体融合,获得了USDA2370和CCBAU110的属间融合菌株,该融合菌株可分别在双亲寄主植物上结瘤。JianxiuYu等将BacillusthuringiensisS184和TnX两菌株进行融合,将cyt1Aa和cry11Aa基因成功地组合到一个菌株中,得到高毒力菌种。林红雨等将串联发酵D-葡萄糖产生2-酮基-L-古龙酸的欧文氏菌和棒杆菌的细胞融合,获得能够稳定地将D-葡萄糖一步转化为2-酮基-L-古龙酸的融合子。唐宝英等将具有解钾活性的硅酸盐细菌-胶质芽孢杆菌(B.mucilaginesus)W9-12与具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)B179208原生质体进行了融合,融合子既具解钾活性,又具有杀虫活性。陈五岭等在双亲灭活原生质体融合选育苏云金杆菌新菌株的过程中,最终筛选出1株毒力效价较双亲分别提高41%和117%的新菌株。王宪川等应用原生质体融合技术,得到了即杀鳞翅目昆虫,又杀双翅目害虫的重组菌株。又如枯草芽胞杆菌(B.subtilisTG26)产生抗菌蛋白,能抑制同种或不同种属微生物的生长。B.thuringiensissubsp.PacifeusAS1.904产生伴胞晶体蛋白,能杀植物害虫。王雅平等通过原生质体融合获得了能表达亲株抗菌蛋白和毒素蛋白的融合株。原生质体融合技术广泛应用于酶的研究。研究最多的是淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶,主要用于提高菌种的产酶活力、改变菌种酶分泌的种类或使产酶菌种获得新的优良性状等。日本Waseda大学应用此技术以柠檬酸生产菌株黑曲霉(A.niger)和纤维素酶产生菌绿色木霉(Trichodermaviride)为亲本,融合后筛选到一类融合子能在甘蔗渣固体培养基上生长产生柠檬酸。融合子兼具了绿色木霉产纤维素酶的能力和黑曲霉产柠檬酸的能力。王萍等以多粘芽胞杆菌(β淀粉酶高产菌株)和芽胞杆菌菌株(产耐热性β淀粉酶,活性低)进行融合研究,得到了产酶能力介于两亲株之间,酶的热稳定性较高的融合株。曹军等以栖土曲霉种内非营养缺陷型进行原生质体融合,融合子为杂合二倍体,产角蛋白酶活力较亲本显著提高。4菌株融合技术微生物处理污水技术往往涉及多种微生物、多种菌的优化组合,原生质体融合技术可以将多个菌的功能组合到一个菌。许燕滨等采用原生质体融合技术,将两株具有含氯有机化合物降解特性的菌,假单胞菌T-1和诺卡氏菌RB-1融合构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌。应用于造纸漂白废水,融合菌去除CODCr和TCL的能力,比混合菌分别提高了72.05%和190%。周德明采用原生原体融合技术将球形红假单胞菌和酿酒酵母构建成高效降解工程菌,用于废水处理的比降解率明显提高。裘娟萍等以红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)AS2.1557为出发株,经诱变育种总色素含量提高8.5倍,总色素产量提高2倍。用生长弱、含量高的突变株与生长快、含量低的野生型进行原生质体融合,融合子产量比高产亲株提高169%。程树培等将光合细菌与酵母菌进行原生质体融合,用于连续发酵豆制品废水处理。将酿酒酵母与热带假丝酵母原生质体融合而成的杂种酵母细胞,在净化味精废水产生单细胞蛋白方面优于双亲菌株,该杂种细胞以无菌液体石腊复盖,存放于4℃冰箱1年之后,测定其菌体的比增长率,对淀粉的利用率、耐热性能、絮凝性能和菌体蛋白的水平,同时与双亲株的同类指标进行比较,发现该杂种酵母细胞仍然综合了双亲的优势,显示出多功能性的特征。5原生质体融合技术裘娟萍等以原生质体融合技术构建广谱抗噬菌体菌株。通过原生质体融合技术还可对耐热机理进行研究。如有一株耐高温酵母一旦经EB诱变失去线粒体变为小菌落后,即失去耐高温特性。说明耐热性与线粒体有关系。因而应用原生质体技术对耐热性的转移和对耐热机理进行研究将是一条途径。蒋文泓等以禽多杀性巴氏杆菌5A弱毒菌株与禽大肠杆菌02弱毒菌