共济失调血管瘤扩张症am基因的2例突变分析

共济失调血管瘤扩张症am基因的2例突变分析

共济失调（at）是一种罕见的共济失调（ar）疾病，发病率约为14.1/10万。临床上主要表现为进展性脑瘫共济失调、结膜充血、面部皮肤毛细血管扩张、反复发作性呼吸道感染。同时，它对辐射有非常敏感的敏感性，染色体不稳定，容易患肿瘤、免疫缺陷和抗辐射疾病。Savitsky和Uziel等率先克隆AT的疾病基因(ATM),并将其定位于11q22.3。目前国际上已报道了400余种ATM基因突变类型。为了解ATM基因在中国人AT患者中的突变情况,我们应用聚合酶链反应、逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)结合DNA序列分析方法,对近年来收集到的2例中国人AT患者进行了ATM基因的突变研究。1对象和方法1.1年龄、年龄及性别分布2例AT患者为中南大学湘雅医院神经内科门诊及中国医学遗传学国家重点实验室所收集,均来自湖南省,汉族人。发病年龄分别为9岁(男性)和10岁(女性),病程分别为4年和5年,临床诊断均符合Harding标准。无家族史,父母均系近亲结婚,遗传方式符合AR。对照组为100名健康成年人,以确定所检测到的变异是否系ATM基因的多态现象。1.2基因组dna提取抽取患者及其父母和100名无血缘关系的健康成年人外周静脉抗凝血10ml,按标准酚/氯仿法提取基因组DNA,按GIBCOBRL公司的TRIzol试剂说明提取总RNA。1.3选择和检测突变因素1.3.1引用和设计PCR引物覆盖ATM基因全编码区,是参照Telatar等设计并作一些修正,由上海博亚公司合成。1.3.2pcr扩增及条件2μgRNA中加入0.5μg引物OligodT,加入无菌水使总体积≤15μl,70℃灭活5min后置于冰上,离心后加入M-MLV5×缓冲液5μl,200μmol/LdNTP,25U酶抑制剂,200U逆转录酶M-MLVRT,用无菌水补至25μl,42℃水浴1.5h。以cDNA为模板进行扩增,上述设计的引物为特异性引物,β-actin作内对照。PCR总反应体积为25μl,其中DNA模板为50ng,dNTP为200μmol/L,特异性引物各为10pmol/L,β-actin引物各为3pmol/L,MgCl2为1.5mmol/L,10×缓冲液2.5μl,TaqDNA聚合酶为0.5U。PCR反应条件为:在PE9600热循环仪(美国PE公司)上95℃预变性4min后95℃变性40s,65℃退火1min(每个循环降低1℃),72℃延伸3min,共15个循环;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸3min,共25个循环;最后72℃延伸10min。取4μlPCR产物,上样于6%聚丙烯酰胺凝胶,电泳条件为0.5×TBE电泳缓冲液,300V恒电压,电泳时间40min,硝酸银染色观察结果。1.3.3测序结果比较按常规方法回收纯化PCR产物,经ABI3100自动测序仪正反向测序,测序结果与人类基因组ATM基因序列比较(GenBank序列号607585),使用DNASTAR软件分析结果。1.4根据sdna水平，突变1.4.1引用和设计根据RT-PCR及测序结果,在ATM基因gDNA序列相应的外显子上设计引物(表1),由上海博亚公司合成。1.4.2pcrtaqnaPCR总反应体积为25μl,其中DNA模板为100ng,dNTP为200μmol/L,特异性引物各为10pmol/L,MgCl2为1.5mmol/L,10×缓冲液2.5μl,TaqDNA聚合酶为0.5U。PCR反应条件为:在PE9600热循环仪(美国PE公司)上95℃预变性4min后95℃变性50s,60℃退火30s(每个循环降低1℃),72℃延伸1min,共10个循环;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸50s,共25个循环;最后72℃延伸10min。取4μlPCR产物,上样于6%聚丙烯酰胺凝胶,电泳条件为0.5×TBE电泳缓冲液,300V恒电压,电泳时间40min,硝酸银染色观察结果。1.4.3测序结果比较按常规方法回收纯化PCR产物,经ABI3100自动测序仪正反向测序,测序结果与人类基因组ATM基因序列比较(GenBank序列号607585),使用DNASTAR软件分析结果。2pcr扩增结果及分析对ATM基因从cDNA扩增后进行DNA序列分析发现异常后,再在ATM基因gDNA序列相应的外显子上设计引物行PCR扩增,经DNA序列分析,共发现3种ATM基因突变(表2,图1、2):患者1为纯合突变,其父母均为携带者;患者2为复合性杂合突变,其错义突变6679(C→T)来自母方,而无义突变610(G→T)来自父方。3at基因突变共济失调毛细血管扩张症1941年由Louis-Bar首次报道,故又称Louis-Bar综合征。它是一种临床表型和发病机制均很复杂的遗传病,临床确诊有时很困难,基因诊断是诊断该病的金标准,且有助于早期诊断、症状前诊断及产前诊断,对开展遗传咨询有重要意义。ATM基因全长约150kb,cDNA12kb,共有66个外显子,第4外显子为第一个编码外显子,开放阅读框(openreadingframe,ORF)有9168个核苷酸,编码一个有3056个氨基酸残基,分子质量为350000u的蛋白质ATM。ATM基因的突变具有极高的异质性,突变方式和突变检测都极为复杂。到目前为止,国外已经报道了400余种ATM基因突变,绝大多数AT患者为复合性杂合突变,突变形式有错义突变、无义突变、剪切位点突变、小片段插入突变、小片段缺失突变、大片段缺失和同义突变等,突变位点遍布基因全长,无突变热点。研究表明,世界各地ATM基因的突变频率存在明显的种族和地理差异性,在以色列犹太人群中最常见。本研究中2例中国人AT患者的ATM基因突变分析,共发现3种点突变,其中2种为错义突变,1种为无义突变。患者1发生的错义突变1346(G→C)为纯合突变,父母均为携带者,编码氨基酸由甘氨酸(Gly)变为丙氨酸(Ala)。患者2为复合性杂合突变,其错义突变6679(C→T)来自母方,编码氨基酸由精氨酸(Arg)变为胱氨酸(Cys);其无义突变610(G→T)来自父方,编码氨基酸由甘氨酸(Gly)变为终止密码子(Term)。这是国际上尚未见报道的3个ATM基因新突变。研究表明,不同的ATM基因突变类型造成AT患者的表现型、疾病严重程度和预后存在较大差异。本研究中2例患者的基因突变类型不同,而临床表现和疾病严重程度却相差不大,原因不明,有待于进一步研究。国外研究报道AT患者易并发淋巴瘤、白血病、乳腺癌等恶性肿瘤,尤以杂合子风险更高[7,8,9,10,11,12,13]。在本研究中未见发生,可能是病程还不长的原因,有待于进一步追踪。由于本研究中样本量较少,无法研究AT患者的表现型和ATM基因突变类型的相关性,下一步我们将扩大样本收集量,将AT的基因突变研究深入开展下去。ATM基因的克隆为AT的基因诊断和症状前诊断奠定了基础,并且很大程度上解决了该病临床诊断困难的问题,但是ATM基因突变如何引起AT的机制尚不清楚。ATM蛋白在胎儿和成人组织内均有广泛表达,其功能域包括磷酯酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3kinase,PI3K)、Rad3、亮氨酸拉链(leucinezipper,LZ)、局部的连接区域(focaladhesiontarget,FAT)、局部的连接区域C端(FATC)等。PI3K蛋白家族成员