固相萃取-超高效液相色谱电喷雾离心串联质谱法同时测定饮料中13种禁限用食品添加剂

固相萃取-超高效液相色谱电喷雾离心串联质谱法同时测定饮料中13种禁限用食品添加剂

食品添加剂广泛应用于现代食品行业。为了确保消费者的安全，确保添加剂的有效性和适量添加，中国严格限制了甜味剂、洗涤剂和棕榈油等药物。现有的检测方法报道有:光谱法、气相色谱法、离子色谱法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法等。光谱法由于其抗基质能力差,检测限受到了一定的影响;气相色谱法针对一些不可挥发的物质需要繁复的前处理过程或者衍生过程,不利于快速分析;而离子色谱在分离和检测方面还有一定限制,应用范围稍窄;液相色谱则由于紫外检测的通用性,有时会由于杂质而造成目标物质的干扰,会有假阳性或者假阴性的误判,而且常规的液相色谱在分离多组成分的时候,分析时间偏长。近年,超高效液相色谱(UPLC)的分析速度快,分离效率高的特点,以及质谱灵敏度高、专一性强等优点被广泛关注,逐渐成为分析微量、痕量禁限用成分的首选方法。本文建立了固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法(SPE-UPLC-MS/MS),利用SPE柱净化样品,富集目标物质,UPLC梯度快速洗脱分离,电喷雾离子化,多反应监测模式(MRM)检测定量,实现了饮料中13种食品添加剂的同时快速检出。1实验部分1.1标准溶液及标准品ACQUITY-ZEVOTQ超高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪(美国,Waters公司);Milli-Q超纯水纯化系统(美国,Millipore公司);AE200分析天平(瑞士METTLER公司);SK5200型超声波振荡器(上海科导超声仪器有限公司);0.22μm有机针式过滤器(上海安谱科学仪器有限公司)。HLB固相萃取小柱(3cc,60mg),Waters固相萃取装置(美国,Waters公司)。标准品日落黄(Sunsetyellow,纯度>87%),诱惑红(AlluraredAC,纯度>80%),酸性红18(PONCEAU4RC,纯度>70%),柠檬黄(Tartrazine,纯度>99.9%),酸性橙Ⅱ(AcidorangeⅡ,纯度>99.9%)均购自美国Fluka公司。标准品安赛蜜(Acesulfamepotassium,纯度>99.9%),糖精钠(Saccharinsodium,纯度>99.9%),甜蜜素(Sodiumcyclamate,纯度>99.9%),山梨酸(Sorbicacid,纯度>99.9%),对羟基苯甲酸甲酯(Methylparaben,纯度>99.9%),对羟基苯甲酸乙酯(Ethylparaben纯度>99.9%),对羟基苯甲酸丙酯(Propylparaben,纯度>99.9%),对羟基苯甲酸丁酯(Butylparaben,纯度>99.9%)均购自美国SUPELCO公司。准确称取(精确到0.1mg)适量固体标准品于50mL容量瓶中,用甲醇定容,分别配成1000mg/L的标准储备液,储存于4℃冰箱内,备用;吸取适量的标准储备液,用水定容分别配制所需浓度的混合标准溶液,如需要,用水继续稀释成所需要的系列混合标准溶液。乙酸铵(纯度>98.0%)、乙酸(纯度>99.8%,色谱纯)均购自CNW公司,甲醇(色谱纯)购自美国TEDIA公司,氨水(分析级)购自重庆川东化工厂。实验用水均为去离子水,均取自Millipore纯水仪。1.2仪器分析条件1.2.1柱温、进样量、流动相及洗脱程序ACQUITYUPLCTMBEHC18柱(50×2.1mm,1.7μm,);流速:0.2mL/min;柱温:35℃,进样量:10μL;流动相:A为10mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%乙酸),B为甲醇;梯度洗脱程序为:0.0~2.0min,5%B;2.0~6.0min,5%B递增至30%B;6.0~12.0min30%B递增至90%B;12.0~13.0min,90%B,13.5min还原为初始状态5%B。1.2.2脱溶剂气体流量离子源:ESI;离子源温度:150℃;采用脱溶剂气体(高纯氮,>99.999%)流量:1000L/h;脱溶剂温度:500℃;锥孔反吹气:50L/h;碰撞气:高纯氩Ar。1.3清液制备饮料碳酸饮料:将饮料样品倒入烧杯中,室温下超声15min以除去溶液中的气体,备用;果汁等有沉淀物的饮料:将适量饮料样品倒入离心管中,以10000r/min的转速离心5min,抽取上层清液备用。准确称取处理好的饮料样品1g(精确至0.1mg)至10mL刻度管中,加入适量的水,超声充分混匀后,定容备用。固相萃取净化:固相萃取小柱预先利用3mL甲醇和3mL水进行活化和平衡,然后准确取上述步骤处理过的样品清液2mL,以1.0mL/min的流速通过萃取柱进行萃取净化,之后用0.1%乙酸水溶液清洗萃取柱,弃去清洗液,之后利用100%甲醇(含1%氨水)2mL进行洗脱,收集洗脱液,之后用水定容至10mL,利用0.22μm有机针式过滤器过滤,以备进样。2结果与讨论2.1质谱条件优化首先采用Infusion的模式对13种目标物质连续直接进样,根据分析物质的化学性质,在正负两种电离模式下优化目标物质的母离子和特征子离子以及相应的质谱参数,通过质谱条件优化,各个分析物质优化后的质谱分析参数,结合色谱条件,其保留时间、扫描模式、电离模式,质谱优化参数见表1。(续表1)2.2酸处理剂的用量本实验研究了水-甲醇和水-乙腈体系。体系中添加了乙酸铵不仅能够提高分离物质在色谱柱上的保留,而且能够提高目标物质的电离化程度,增加信号响应;而酸的加入作为分离的调节剂,抑制极性物质电离,保证分析物质以分子状态在色谱柱上更好的保留,且对于正离子化模式的物质有促进电离的作用。综合比较了10mmol/L乙酸铵(含0.1%乙酸)-乙腈体系和10mmol/L乙酸铵(含0.1%乙酸)-甲醇体系,考虑分离效果以及检测物质信号强度等因素,最终选择10mmol/L乙酸铵(含0.1%乙酸)-甲醇作为流动相进行梯度洗脱,13种目标物质峰形对称,响应强度高。2.3洗脱溶剂的选择HLB固相萃取柱吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物,其保留机理为反相,通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留,因此很适合本研究工作。对于有气体干扰的碳酸饮料首先对其进行超声以排除溶液中气体,对于部分有果肉或其他固体沉淀物的饮料,则首先对其进行离心处理。固相萃取实验中,影响最大的就是洗脱溶剂的选择。分别考察了100%甲醇(含1%氨水)、90%甲醇(含1%氨水)、70%甲醇(含1%氨水)、50%甲醇(含1%氨水),可以发现氨水的添加可以极大的影响色素类物质的回收率,各个目标物质的回收率均在85%以上,但是随着洗脱液中水比例的增加,酸性橙Ⅱ、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的回收率受到的波动较大,水相的增加,洗脱强度的降低也导致目标物质回收率的相应降低,50%甲醇(含1%氨水)洗脱液对于三种物质的回收率更是小于20%。综合考虑各个物质的回收率情况,本实验选择100%甲醇(含1%氨水)作为前处理萃取的洗脱条件。2.4线性回归的测定在优化的条件下,分别对所配制的2~500μg/L系列浓度的混合标准溶液进行测定,以目标物质的色谱峰面积y对其质量浓度x(μg/L)进行线性回归。从表2中可以看出,13种目标检测物质在相应浓度范围内,相关线性关系良好,相关系数均大于0.990,检出限为0.20~6.79μg/L。2.5加标回收率和精密度在优化的实验条件下,向所要考察的饮料样品中添加10、50和100μg/L的标准溶液,每个添加水平平行测定5次,进行加标回收率和精密度的测定,所得到的平均加标回收率结果和相对标准偏差(RSD)结果见表3。2.6样品的测定结果分别对市售的六种不同类型的饮料(包括2种碳酸饮料,2种果汁饮料,2种茶饮料)进行检测,有一个样品检出柠檬黄,含量为0.50mg/kg,有两个样品检出安赛蜜,含量分别为0.70mg/kg和0.55mg/kg,有两个样品检出对羟基苯甲酸甲酯,含量分别为0.75mg/kg和0.90mg/kg,对照国家标准(GB2760-2011),所检测结果均在标准要求范围内,符合国家规定。3流动相-色谱-质谱条件本研究建立了同时检测饮料中13种食品添加剂(包括3种甜味