小分子药物靶点的发现

小分子药物靶点的发现

人类在使用小分子药物方面的应用已经使用了几千年。许多蛋白质相互作用研究技术已经发展，以研究蛋白质化合物与蛋白质分子之间的相互作用，并找到了药物的靶点。然而，许多小分子药物的作用模式和作用机制尚不清楚，目标点的检测和发现仍处于瓶颈阶段。小分子药物作用的靶点通常是蛋白质,要对药物作用靶点有全面和深入的认识,必须要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。传统的对单个蛋白质研究的方式已经无法对蛋白质功能和蛋白质间的相互作用进行完全的阐述,因此产生了一门新兴学科——蛋白质组学(proteomics),它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象的组学研究方法。蛋白质组学的研究内容有两个重要方面:结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要是蛋白质结构模式的研究,包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析;功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究,包括蛋白质的功能和蛋白质间的相互作用。蛋白质功能模式的研究是蛋白质组学研究的最终目标,其研究方法与传统的蛋白质研究技术不同,它是应用许多新技术手段,通过系统性、整体性研究,并从相互联系的新视角来研究,以便得到生物体生理、病理和信号转导过程的功能整合信息。化学在这里与生物学的最新发展融合,形成新的交叉研究领域——化学蛋白质组学(chemicalproteomics)。1化学蛋白质组学化学蛋白质组是全蛋白质组的一个亚类,而化学蛋白质组学是一个目前仍在不断扩展中的全新领域,学术界至今对其尚未有确切定义,作为后基因组时代的新技术,是联系蛋白质组和药物靶点研究及新药研究的桥梁和纽带。化学蛋白质组学有别于以往的主要以蛋白质定性定量鉴定为基础(identitybasedorabundance-based)的蛋白质组学技术。化学蛋白质组学是利用能够与靶蛋白质发生特异性相互作用的化学小分子来干扰和探测蛋白质组,在分子水平上系统揭示特定蛋白质的功能及其与化学小分子的相互作用,从而准确找到化学小分子(包括药物)的结合部位——作用靶点的组学研究方法。因此,化学蛋白质组学被认为是很有前途的新一代基于功能的蛋白质组学技术(function-basedproteomics)。2小分子靶点的发现和确认小分子靶点是能够与小分子化合物发生特异性结合,并能产生特异的生理效应或药理效应,调节机体生理功能或防治疾病的生物大分子。目前药物的靶点主要是蛋白质。小分子药物与靶蛋白的相互作用是很多药物发挥生物学功能的基础。细胞内挤满了密集的蛋白质,一个小分子化合物进入细胞可以遇到许多不同的蛋白质,并产生不同程度的相互作用。这种相互作用强弱不一,既可以是可逆的,也可以是不可逆的;可以是单靶点的,也可以是多靶点的作用,对机体生理学功能或药物作用产生影响。目前已知的药物作用靶点约有500个,而根据人类基因组研究结果预测的细胞内药物分子能作用的靶点应远远超过500个,据保守估计,约有5000~10000个药物靶点,是目前已知靶点数目的10~20倍。显然,“一个药一个靶点”的说法并不正确,已发现很多复合物的作用比原先预期的复杂得多,有的能导致副作用,而有的可能展现出其他医学用途。当研究向系统生物学和个性化医疗发展时,分析化学小分子与靶点相互作用的信号和代谢规律变得日益重要,医学和药学界急需发现和确认新的靶点。小分子靶点的发现和确认对于生物和医学的研究者而言,是一项既重要又艰巨的任务。而应用化学蛋白质组学方法能在上千万个蛋白质分子中分辨出正常和病变蛋白质的细微区别,以便药物的靶向鉴别。3化学蛋白质组的研究方法化学蛋白质组学是化学生物学研究的重要技术手段,随着科学技术的进一步发展,化学蛋白质组学的研究方法也不断更新,目前的方法有以下几种。3.1高灵敏度质谱条件考察化学蛋白质组学研究方法的一般流程是,先将化学探针或小分子化合物与蛋白质提取液进行共孵育,然后利用亲和层析等方法将这些蛋白质加以分离,再通过高灵敏度的质谱进行鉴定,最后对它们做进一步的生物信息学分析。主要有如下两种方式。3.1.1化学探针abpp技术生物体的蛋白质组要比基因组大得多,通常都是在整体水平上研究感兴趣的功能蛋白质。美国Scripps研究所的Cravatt小组发展了一种新的化学蛋白质组学技术,利用基于靶酶活性的特异化学小分子探针(activity-basedprobes,ABPs)来探测功能蛋白质组,利用活性小分子探针来识别蛋白质靶点,这种方法建立了一种非常有效的未知靶点发现的策略。化学探针即探测用的工具,是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子,并可以被特殊的方法所检测。就化学探针的基本结构而言,包括3个特异的功能部位:与酶共价交联的反应基团,调节反应基团反应的链接区和一个便于鉴别和纯化目标酶的标记物。现有的化学探针多以半胱氨酸蛋白酶家族和丝氨酸水解酶家族为靶点。除了化学探针的数目在不断增长,许多抑制剂或亲和标记试剂的出现都将有助于发展出新类型的探针。ABPP技术的原理是合成同时带有反应基团和标签基团的ABPs试剂与待研究的蛋白质组作用:ABPs中的反应基团能够特异性共价修饰蛋白质组中的某类酶蛋白而将化学小分子“挂”到感兴趣的靶酶上,然后利用ABPs中的荧光或生物素标签基团又可将这些靶酶一个个地从蛋白质组中“钓”出来,由于ABPs是针对待研究靶酶的活性而定向设计的化学小分子,因而能够直接检测蛋白质组中感兴趣的靶酶的活性。通常,ABPP用来检测某些情况下,例如某疾病中,有活性的限定酶种类的成员。此方法能用于具有不同生物化学活性的新蛋白质的鉴别,或用于确定以某酶家族为靶点的药物的选择性分析,通过用药物预处理,用合适的反应探针进行后续标签和识别剩余的酶,再结合计算机技术处理复杂的蛋白质组学数据,可得到高精度的细胞靶蛋白模型。3.1.2以化合物为中心的化学固体分析ccc3.1.2.亲和标记的应用迄今为止有很多靶点发现的技术,但亲和层析仍然是最为常用的方法。经典的工作会从结构-活性关系(structure-activityrelationship,SAR)研究开始,通过对不同功能的目标化合物进行修饰或剔除,以确定哪些结构对于药物活性是非必需的。这些非必需的位点就被用于连接到一个亲和标签,比如生物素(biotin)或者固体基质胶、Affi-Gel琼脂糖珠子,然后与用抗体和蛋白免疫共沉淀特异蛋白质类似,连接了药物的珠子与蛋白质提取物共孵育,再高强度洗涤掉非特异性结合的蛋白质,最后紧密结合的蛋白质由过量的游离药物洗脱下来或者通过高度变性条件洗脱。最为常见的分析洗脱下来的蛋白的方法是通过SDS电泳以及质谱鉴定蛋白条带检测。考虑到一般都有比真实药物靶点更多的非特异结合蛋白,常同时进行相似标签标记的母核化合物的同源化合物的阴性对照试验。一旦可能的靶点被发现,接下来的研究就是确认直接结合的靶点以及生物学作用。亲和层析的最大局限性在于必须获取目标化合物的衍生物。结构-活性关系研究不仅耗费时间而且需要大量的药物化学方面的专门技术,而这恰恰是进行化学遗传学研究及小分子表型筛选的研究室所缺乏的。即使可以做到,大量的小分子也不能在不影响生物活性及可能结合的情况下被修饰,而且也不易获得和合成足够数量的化合物以满足结构-活性关系研究以及后续的实验。尽管如此,与其他新近发展的依靠不同表型或者分子特征去缩小可能靶点范围的靶点发现方法相比,基于亲和标记的方法的优势在于其仅依靠药物与其靶蛋白的结合,而不是依赖于特异性的细胞或生化的参数,这些可能只适用于少数化合物。由于众多的结构差异以及生物活性小分子的复杂性,小分子的亲和层析的研究是严重受限的,而且它也必须有一个合适的无活性小分子作为阴性对照,这也不易做到。3.1.2.darts的应用考虑到现在靶点发现方法学上的缺陷,想要取得突破就应该寻找其他的研究方法。溶菌酶的结构稳定性依赖于底物的结合是一个为人所熟知的现象,使溶菌酶对热与促溶剂导致的变性的抵抗增加。这种增加的稳定性可能是源于蛋白质为了适应配体结合而发生了热动力学的转变,从而限制了蛋白质自身的灵活性和运动能力。另一个最近的支持该模式的实例是,发现FK506可以在DARTS中保护FKBP12,形成一种高稳定性的骨架构象。配体诱导的稳定性已经通过大量技术应用于检测和分析特异性的配体-蛋白相互作用。它已经被用于纯化天然折叠的重组蛋白质接着再用蛋白结晶进行结构鉴定。这种靶点发现策略的优点是,仅依靠药物和蛋白直接结合而并不需要对小分子化合物进行修饰,从而确定出小分子的任意靶点。因此,可采用小分子稳定其靶蛋白的结构从而导致蛋白酶抵抗,结合质谱分析等方法发现未知靶点。DARTS提供了一种前所未有的能力去确定小分子的靶蛋白。它与亲和层析有一定相似性,两者都是基于亲和标记的方法,并开始于复杂的蛋白样品和选择性富集靶蛋白同时去除全部非靶蛋白。然而,亲和层析利用的是通过选择性沉降靶蛋白并去除非靶蛋白的正性富集方式,DARTS则利用的是消化掉非靶蛋白而留下诱导产生蛋白酶抵抗的靶蛋白的负性富集方式。亲和层析历经数十年的应用,其优势和缺陷已经很明确。例如:它最大的缺陷就是常常出现大量的非靶蛋白非特异性地结合在基质胶上,因此妨碍了靶蛋白的分离。尽管高强度的洗涤可有助于减少非特异结合蛋白的数量,但具有较弱亲和力的真正相互作用的蛋白质也会在洗涤过程丢失。相反DARTS不需要洗涤,它可以被用于分析较低亲和性的蛋白质的相互作用。DARTS还具有直接使用原始小分子而不需要化学衍生,甚至不需要知道其确切化学结构或化合物的纯度的优点。正因为这样,DARTS可将具有生物活性的天然产物提取物在分离之前就用于靶点发现因此可以用来研究多靶点药理学以及复方药物(如中药)。这是其超越亲和层析以及其他以往方法的最大优点。3.2分子探针方法蛋白质芯片的发明为蛋白质生化活性的全面分析带来了变革,其中包括对小分子化合物与蛋白质相互作用的研究。蛋白质芯片是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。它是指在硅物质如玻璃等固相支持物表面高密度排列的探针蛋白微阵列,通过抗原-抗体专一性结合等各种相互作用,可特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。在这种方法中,需要标记小分子,使其能被跟踪到在蛋白质芯片上的结合位置。蛋白质芯片上的探针蛋白可根据研究的目的不同,选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物活性、高度特异性和亲和性的蛋白质。亲和层析中常用的标记物也可以被用作蛋白质芯片的探针,包括亲和标签(如生物素)、荧光标签、光化学标签及放射性同位素。蛋白质芯片技术关键的优势在于其可以在一个芯片中分析药物与整个蛋白质组的结合,可以显示全部的结合靶点,也包括“脱靶”。然而,也存在与亲和层析相同的缺陷就是需要小分子标记,并需要可以用于标记的基团且不能影响化合物的生物活性。这种方法将会随着非标记结合检测与蛋白质芯片联用技术的发展而得到大大的改进,如表面等离子共振技术(SPR技术)等。3.3小分子与蛋白质相互作用说执行生理功能时,蛋白质的表现是多样的、动态的、呈级联因果、形成网络的。因而2004年Barabasi等提出了网络生物学的概念,该学说认为通过建立网络模型,可以将生物体内复杂的蛋白质相互作用抽象表达成网络,通过对复杂网络的成分关系和特性分析,得出小分子与蛋白质相互作用的机制和部位。网络生物学为化学蛋白质组学的研究提供了一个全新的视角,利用蛋白相互作用数据库信息可以构建针对某种疾病或某个药物的靶蛋白网络,选择恰当的生物信息学方法进行数据分析、验证,从网络生物学角度阐明药物作用机制及作用靶点。4提高药物发现效率的方法化学蛋白质组学作为一种新兴的组学研究方法,其技术和方法将不断成熟,在药物作用靶点的发现、确认和药物的优化等方面都将起重要的作用,并将大大提高药物发现的效率。4.1半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂的筛选化学蛋白质组学是药物靶点确认的一个重要方法。靶点的发现和确认很复杂,一个简单的靶点的确认可能要消耗大量的时间和金钱。化学蛋白质组学靶点确认成功应用的一个例子是阻断疟原虫入侵血红细胞的靶点研究。半胱氨酸蛋白水解酶是疟原虫(Plasmodiumfalciparum)生存必需的酶,Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化学探针(125I.DCG-04)打靶,然后通过抗DCG-04的生物素纯化,得到了半胱氨酸蛋白水解酶类的亚蛋白质组,通过酶活性分析,最终发现在疟原虫入侵血红细胞的裂殖期,仅有1个具有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白质——falcipain1。从化学数据库筛选到falcipain1的抑制剂是YA29.Eps,结果证实YA29.Eps可阻断疟原虫入侵红细胞。另一个成功的例子是2010年陈竺、陈赛娟院士领导的课题组应用化学蛋白质组学技术,解析三氧化二砷(俗称砒霜)治疗急性早幼粒细胞性白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)的分子机制,揭示了癌蛋白PML-RAR是砷剂治疗APL的直接药物靶点。该实验组发现三氧化二砷直接与癌蛋白PML端的“锌指”结构中的半胱氨酸结合,诱导蛋白质发生构象变化和多聚化,继而发生SUMO化、泛素化修饰而被蛋白酶体降解。APL癌蛋白的降解最终导致白血病细胞走向分化和凋亡,使APL成为人类急性白血病分子靶向治疗取得临床治愈的成功范例。这一成果丰富了APL靶向治疗的理论,对于推动其他类型白血病和实体瘤的分子靶向治疗研究具有十分重要的指导意义。4.2优化药物作用的多靶点联合用药是两种或两种以上的药物同时或先后使用。联合用药时,不同的药物之间必将产生相互作用,可表现为协同作用和拮抗作用。其协同作用往往是因两种以上的药物作用于同一靶点或是不同的药物作用于多个靶点而致药物作用相加或增强。而其拮抗作用可能因作用相反的药物竞争性拮抗同一靶点或不同的药物作用于效应相反的不同靶点所致。联合用药时药物作用的多靶点能够使一个药物应用于治疗多种不相关的疾病,而如果药物不只影响一个与某特殊疾病有关的靶点,它在治疗性应用时就可能有更强的疗效,但多靶点药物作用也会导致不良反应。因此可通过化学蛋白质组学技术进行研究,获得相关的蛋白质靶点的信息,通过比较不同药物之间靶蛋白质及其生物功能的相关性,借助网络生物学技术来阐明药物联合使用时在分子水平上的协同作用和拮抗作用机制,则能够通过联合用药或调整药物来预防不良反应的发生。目前,化学蛋白质组学已被用于确定药物靶向的关联性及系统分析药物的特异性和选择性,确认疾病所依赖的生存体系和发现新的药物靶点,引领制造新的靶向药物,发挥联合用药时药物全部的治疗潜力并使毒性最小,保障用药安全。4.3化学蛋白质组学中药常常是复方使用,配伍药物较多、化学成分复杂,药理作用具有多靶点、多环节、多层次的特点。化学蛋白质组学对中药研究的意义并不仅仅在于它是否能发现新的中药治疗药物,更重要的是可减少中药靶点寻找中的盲目性,加快靶点的探测速度。中药有效成分复杂,作用于人体,可能会引起分子、细胞、器官、整体多个层次的结构和功能状态的改变,调节这些层面的结构和功能的本质是基因,而直接作用者主要是蛋白质。化学蛋白质组学可以筛选中药的有效成分,通过检测中药有效成分的活性来验证可能的靶点,通过筛选小分子配体与蛋白的结合来描述蛋白质的功能。化学蛋白质组学技术在中药领域的应用变得日益重要,将成为中药新药研发和靶点发现的重要技术。目前,已经有许多基于化学蛋白质组学的方法来鉴别和验证中药靶蛋白质的例子。如陈竺、陈赛娟院士领导的课题组揭示了中药复方黄黛片(RealgarIndigoNaturalisFormula,RIF)治疗APL的多靶点协同作用机制,首次在分子网络水平阐明了中药复方的治疗机制。5化学蛋白质组学化学蛋白质组学是至今尚未有确切定义的一种功能蛋白质组学研究方法。这种方法可探测整个蛋白质组或