玉米蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳法检验中常见的问题

玉米蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳法检验中常见的问题

采用电泳法对样品的种子和幼苗的蛋白质进行分离和染色，形成蛋白质电泳带的差异，并将其与标准品种进行比较。以确定品种的真实性和纯度。不同作物品种的基因不同,基因的直接表达产物———蛋白质在种类、数量、结构等方面也不同。该法即是利用蛋白质的多态性来反映不同品种DNA组成上的差异,从而进行品种鉴定。该法快速、可靠,不受环境影响。其基本操作程序一般包括七大步骤:样品提取→凝胶制备→点样→电泳→谱带染色→谱带鉴定→图谱保存。下面就这七个步骤中常见的问题及原因做简要分析:1样品提取1.1采样不具有代表性：随机采集样品，采集检测霉、变质、昆虫和中毒种子，并进行意外检查1.2样品损失或污染：样品粉末过程中存在损失或粒间交叉污染1.3提取完成后提取液加入后没有充分摇匀,提取期间至少摇匀两次。样品提取时间不宜太长,一般不超过4h。2凝胶制备2.1连接板：玻璃板没有清洁、清洁，导致连接板2.2凝胶不均匀：插入粘合剂时，没有完全摇匀，缓慢。应立即从一端注入，避免泡沫和凝胶不均匀2.3橡胶表面不均匀：打开和分离橡胶时的操作非常简单，样品的清洁应放置在顶部，拔高时应小心维护橡胶表面，以免损坏橡胶表面3采样点的质量3.1采样能力不允许：采样量通常为15l，各槽的采样量应一致。如果谱带太宽，你就不会知道，或者太少，可能会失去谱带3.2样品溶液污染：在采样前，请不要清洁样品装置。如上所述，应清洁每个点2.3次，以防止交叉污染4电泳4.1电泳槽无法通行：电板的反向连接。一般，阳离子电泳包括极接地槽阻力和负接手槽长板4.2绿色标志材料未移动电压设定不合适,应调节电压为500V;也可能室内温度不适宜,电泳温度一般在15～20℃下进行较好。5染色5.1粘合板：取胶时，粘附板非常严重，因为玻璃板没有清洁，需要更换玻璃板5.2染色速度缓慢可能原因是染色温度低,正常染色温度可在室温进行,若希望染色速度加快可适当提高温度。6谱带的确定分析蛋白质电泳谱带的异常情况:大多数杂交种电泳谱带是一致的,但有些杂交种个别籽粒会出现一些异常情况。6.1种谱带型某粒杂交种出现一条该杂交种所不具有的谱带(这称为新谱带型),而其它谱带和该杂交种完全一致。此情况可能是由于制种时某些籽粒发生突变或自交系中有突变体造成的(亲本是二环系或混合体的杂交种易出现),应按杂交种计算。6.2互补带的出现杂交种中有多条互补带出现时,其中某粒可能有一条谱带不出现互补而呈偏亲型谱带出现,其它互补带仍然出现。我们认为该籽粒为杂交种,只是杂交不完全或发生突变。7结果保存光谱带保存7.1湿保存：保存时间短。将凝胶板浸泡在7%乙醇溶液中，并将其放入塑料袋中。这可以保存半年以上7.2玻璃纸沉法或称溶胶质法胶片不理想。制干胶片应将玻璃板充分洗净,在其上面平铺一层已经甘油水溶液(30%)浸透的玻璃纸,然后将胶片洗净,放在玻璃纸上,再盖上一层已经甘油水溶液浸透的玻璃纸,四周压实,贴上标签,自然干躁或放烘箱中(<40℃)缓慢烘干。以上即是蛋白质电泳法玉米纯度检验中常见的问题及原因。虽然从理论上讲,任何玉米品种间的蛋白质组成均存在着差异,但是任何技术均会有局限性,何况