蛋白质组学的研究进展

蛋白质组学的研究进展

21世纪的生命周期研究是一个用“组学”为基本研究单位的高度概括的时代，主要包括基础研究、再现研究、蛋白质研究、糖资源研究、酶反应理论等。因为蛋白质是生物体行使其功能的基本单位,而蛋白质组学是在蛋白质的整体水平上对生物体进行研究,因此蛋白质组学的研究可能更好地帮助人们了解生命的本质,各器官的分子结构、功能及其行使该功能的机制等。也因此,该理论及其技术受到各国学者的高度重视并得到了蓬勃的发展。2001年的Science杂志已把蛋白质组学列为六大研究热点之一,蛋白质组学研究已成为21世纪生命科学的重要战略前沿。1蛋白质的含义1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组(proteome)这个概念,该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成,并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的,而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质。蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。2功能基因组学人类基因组学计划使我们对人类的基因组有了更深入的了解。但是单从基因序列预测基因的功能还是比较困难的,因而产生了多种基于基因组序列下游分析的学科,主要包括转录组学、蛋白质组学、代谢组学等,统称为功能基因组学。转录组学主要是对基因在不同情况下的转录及转录后加工进行研究;蛋白质组学主要是对蛋白质的加工、修饰以及蛋白质之间的相互作用进行研究;代谢组学则是关于定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学。除了代谢组学是在生物体层面进行研究外,基因组学、转录组学和蛋白质组学均在分子水平上进行研究。蛋白质组学是分子研究终点,也是对生物体性状的最直接反映,同时也是目前研究最多、成果较丰富的学科。3结构蛋白质组学根据研究目的的不同,可将蛋白质组学分为蛋白表达蛋白质组学、功能蛋白质组学、转录后加工蛋白质组学、结构蛋白质组学。表达蛋白质组学研究差异样品间蛋白表达量的变化,因此可以用表达蛋白质组学对整体或局部的蛋白表达情况进行比较、分析。利用这种方法找到的信息可以鉴定信号转导中的特殊蛋白,还可以鉴定与疾病有关的蛋白等。结构蛋白质组学的目的是描绘出蛋白质复合体的结构图,亦或描绘出存在于特殊细胞器上的蛋白图谱(又被称为细胞图谱)。结构蛋白质组学试图鉴定出一个蛋白复合物或一个细胞器的所有蛋白,测定它们的位置、特性,研究蛋白质间的相互作用。例如对核孔复合体的研究。特异性地分离亚细胞器或蛋白复合体,可以很大程度地简化蛋白质组学分析。结构蛋白质组学所得到的信息可以帮助我们很好地理解细胞的整体结构,并且有助于解释某一特定蛋白的表达对细胞产生的特定作用。功能蛋白质组学是一个宽泛的术语,包含许多详细的、直接的蛋白质组学方法。有时为了进一步的分析,还需要使用亲和层析技术对特异性亚蛋白组进行纯化。功能蛋白质组学的方法可以更好地分析、阐明被选择的蛋白组分的特征与功能,还可以提供关于蛋白质信号、疾病机制或蛋白类药物相互作用的重要信息。4蛋白质组学技术蛋白质组学的发展有赖于一整套技术,这些技术按照其流程主要包括如下几类。4.1高效液相色谱法这类技术主要是电泳,其中应用最多的是双向电泳技术,其他还有SDS、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱,通常使用高效液相色谱(HPLC)和二维液相色谱(2D-LC)。另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。4.1.1双向电泳的制备(two-dimensionalgelelectrophoresis,2DE)这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术,产生于20世纪70年代中叶,但主要的技术进步(如实验的重复性、可操作性,蛋白质的溶解性、特异性等)是在近10年取得的。双向电泳是通过蛋白质的等电点(pI)和相对分子质量的不同而将蛋白高通量地分离。首先将制备好的样品进行等电聚焦电泳,在这个过程中需要使用固定pH梯度的干胶条。这种胶条目前多为商业产品,是将pH梯度凝胶固定在塑料支持模上,有不同pH值范围的胶条。最常用的2种胶条是pH3~10和pH4~7的胶条。当电场作用于胶条上时,存在于胶条内的带点的蛋白质便根据其所带电荷的正负而反向移动,在移动中蛋白的带电量逐渐减小,直到移动到该蛋白不带电时为止。这时的蛋白质便迁移到了它的等电点处;然后将第一向电泳后的胶条经2次平衡后转移到第二向电泳SDS,将蛋白按照相对分子质量的不同而分开。双向电泳之后的工作便是染色,主要分为考马斯亮蓝染色法和银染法、锌染法、Ruby荧光染色法,它们各有优缺点。考马斯亮蓝染色法的优点是线性范围广,缺点是灵敏度低、需要大量的样品;银染法灵敏度高但线性范围窄,容易造成“火山口”效应;锌染法与银染法类似;荧光染色法相对于前几种来说具有灵敏度适中、线性范围广等优点,但其造价昂贵,需使用特殊仪器且操作复杂。考虑到实验成本与后续质谱实验的特殊性,通常使用考马斯亮蓝染色法或经过修改的银染法(可以与质谱兼容)。4.1.2通过dige技术检测表达差异2D-DIGE分析系统是在传统双向电泳技术的基础上,结合了多重荧光分析的方法,在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品,并第一次引入了内标的概念,极大地提高了结果的准确性、可靠性和重复性。在DIGE技术中,每个蛋白点都有它自己的内标,且软件自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准,这样可以很好地去除样品的假阳性差异点。DIGE技术可检测到表达差异小于10%的蛋白,统计学可信度达到95%以上。利用EttanDIGE技术还可以对微量(少到5μg)样品进行蛋白质组学分析。2D-DIGE的具体操作过程与常规2DE的步骤相似,所不同的就是在样品制备时,在每份样品中预先分别加入不同的荧光染料,并且需要制作一个供其他样品比较的内参,另外在电泳后的凝胶显色时需要在特殊的荧光检测仪中进行。4.1.3复杂混合物的色谱质谱检测高效液相色谱因具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广等特点,广泛应用于生产实践中。高效液相色谱是利用高压输液泵驱使带有样品的流动相通过装填固定相的色谱柱,利用固液相之间的分配机理对混合物样品溶液进行分离的方法。例如对奶粉中三聚氰胺的检测。二维或多维液相色谱,是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。样品经过第一维的色谱柱进入接口中,通过浓缩、捕集或切割后被切换进入第二维色谱柱及检测器。二维液相色谱通常采用两种不同的分离机理分析样品,即利用样品的不同特性把复杂混合物(如肽)分成单一组分,这些特性包括分子尺寸、等电点、亲水性、电荷、特殊分子间作用(亲和)等。在一维分离系统中不能完全分离的组分,可能在二维系统中得到更好的分离,分离能力、分辨率得到极大的提高。完全正交的二维液相色谱,峰容量是两种一维分离模式单独运行时峰容量的乘积。4.2差异蛋白比较分析对目的蛋白的筛选通常与双向电泳连用,主要用来分析凝胶中分离出的蛋白质样品,采用的主要技术手段通常是Western印迹和差异蛋白比较分析。Western印迹主要是将双向电泳后的凝胶不经过染色而直接转印到固相支持物(如NC膜、PVDF膜等)上,再在膜上进行免疫学反应,从而筛选出与免疫功能相关的蛋白;差异蛋白比较分析则是先对凝胶进行染色,然后应用软件(如ImageMaster、PDQuest等)对存在差异的2组凝胶进行比较,从而找出差异的蛋白。在比较时,通常要求每个被分析的样品重复3次,然后先做组内比较,再做组间比较。4.3蛋白质鉴定技术4.3.1仪器和检测方法以前对蛋白质的鉴定主要通过测序来完成。由于质谱技术的高速发展,目前可以快速、高效地对目的蛋白进行鉴定,且样品用量少(通常达到微克级)。除此之外,质谱技术还可以对蛋白质翻译后修饰进行分析。根据离子源的不同,质谱主要包括基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)、电喷射离子井飞行时间质谱(ESI-TOFMS)。常用的质谱分析仪除了飞行时间(TOF)外,还有四级杆(Q)、离子井,而在串联质谱中通常使用的是Q-TOF或TOF-TOF等。2种离子源都可以使肽段、蛋白、药物的代谢产物、寡核苷酸等其他碳水化合物离子化,进而被质谱仪分析。通常的质谱仪一般由样品槽、离子源、分析仪和检测器组成。由于单一地依靠蛋白质相对分子质量并不能对目的蛋白进行理想的鉴定,因此须事先用蛋白酶(如胰蛋白酶)将检测样品酶解成不同长度的肽段。在MALDI-TOF质谱中还需要向样品中加入基质,以促使样品离子化(离子化的确切基质目前还不清楚),然后在离子源的作用(激光激发)下使样品变为气相离子。这些被激发的气相离子进入质量分析仪,根据其荷质比而把肽段进行区分。质谱的整个过程都是在真空条件下进行的。ESI则不需要基质辅助,而是使用具有一定能量的电子直接作用于样品分子,使其电离。4.3.2小体氨基酸序列的检测同时将2个上述质谱连接在一起构成的串联质谱,可以更精确、更灵敏地分析蛋白样品。二级质谱的使用,使得质谱不仅可检测肽段的相对分子质量,还可以检测它的氨基酸序列。利用质谱仪的第一个分析仪对蛋白样品进行初步检测,从样品混合中选择特定的肽段,再将这个特定的肽段与惰性气体(如氮气、氩气等)碰撞,从而将肽段进一步离解。在被选择的肽段与惰性气体发生能量碰撞时,支持蛋白主链构象的化学键受到破坏,碰撞后的结果再被第二级质谱分析仪分析。串联质谱又叫碎片谱或MS/MS谱。在二级质谱中,可以将差别只有1个氨基酸的相邻肽段区分开。因此通过分析临近峰的相对分子质量,可以检测肽段的氨基酸序列。4.3.3质鉴定的实现(peptidemassfingerprinting,PMF)当被离子化的肽段经过质谱仪时,这些肽段因其相对分子质量的不同而被分离,因此产生了含有不同峰值的肽质量指纹图谱。蛋白质鉴定便是通过对PMF的分析实现的,即将所得到的PMF与已知数据库中一个蛋白的理论期望蛋白酶肽段进行比较,可以得到一个匹配程度得分,当这个得分高于理论计算的得分时,便认为该蛋白是理论中的蛋白。这些已知数据库在互联网上有很多,其中NCBI和EBI的数据库是最大的,而且是免费的。在搜索这些数据库时,需要使用搜索软件如Mascot、PepSea、PeptideSearch等,其中Mascot是最常用的软件。最近开发了一个新的程序Paragon,该程序克服了Mascot被动的、概率的、估计的搜索模式所带来的缺点,被认为是Mascot的替代者。4.4生物生物学知识是解决生物解释问题的有效途径经质谱鉴定的样品,只能知道其中含有什么蛋白,但无法获悉这些蛋白在生物体中执行什么功能、空间构象如何、与之同源的蛋白有哪些以及该被测蛋白的属性,需要借助生物信息学知识解决这些问题。生物信息学包含了生物信息的获取、处理、储存、分析和解释等,集合数学、统计、计算机与生物医学等工具研究,阐明大量生物学数据所包含的生物学意义。蛋白质组学研究中应用生物信息学对蛋白质的功能和结构进行进一步的分析。4.4.1通过蛋白序列推算与数据库的比较蛋白功能的预测可以通过3条途径实现。首先,通过与已知蛋白质序列相比较来检测蛋白的功能。此外,蛋白质的一些其他性质可以直接由序列分析得到。比较常用的蛋白质序列数据库是SwissProt、PIR和NCBI的Blast,其次可以通过蛋白质的物理性质的预测。蛋白质的一些功能特征可以通过蛋白序列直接推算出来,通过组成蛋白质的20种氨基酸的物理和化学性质分析已知或未知蛋白质的性质,如等电点/相对分子质量、疏水性、跨膜螺旋、卷曲螺旋及信号肽等。除了上述2种方法外,还可以与保守的基序和图形数据库比较判断功能。对于那些与数据库中已知功能蛋白质无同源性的序列或找到同源性的蛋白质功能为未知时,我们可与保守的基序比较来判断其功能。基序数据库中最为常用的是网站Prosite。4.4.2倾向或者规律统计虽然有时蛋白质的序列相似,但是却执行着不同的功能;或同源基因编码的蛋白质,虽然序列差别很大,但是对于生物体来说执行的却是同样的功能。这主要是因为蛋白质的空间结构发挥了作用。在PDB等数据库中可以检索到一些蛋白质高级结构的同源性。蛋白质二级结构预测的基本依据是每一段相邻的氨基酸残基具有形成一定二级结构的倾向。因此,进行二级结构预测需要通过统计和分析发现这些倾向或者规律。蛋白质二级结构预测的方法有3种。一是由已知结构统计各种氨基酸残基形成二级结构的构象趋势,其中最常用的是Chou和Fasman法;二是基于氨基酸的物理化学性质,包括堆积性、疏水性、电荷性、氢键形成能力等;三是通过序列比对,由已知三维结构的同源蛋白推断未知蛋白的二级结构。一般对于α螺旋预测精度较好,对β折叠差些,而对除α螺旋和β折叠等之外的无规则二级结构则效果很差。蛋白质三维结构的预测是最复杂和最困难的预测技术。序列差异较大的蛋白质序列也可能折叠成类似的三维构象。由于蛋白质的折叠过程并不十分清晰,从理论上解决蛋白质折叠的问题还有待进一步的科学发展,但也有一些有一定作用的三维结构预测方法,如与已知结构的序列比较、同源模建、threading算法和折叠识别方法。尽管生物信息学发展迅猛,但是它仍然不能承载所有的研究信息。虽然通过在生物数据库网站内检索可以得到一定的分析结果,但这个分析结果可能并不完整,比如细菌中的有些蛋白不仅对于机体来说发挥正常代谢的功能,而且该蛋白还具有一定的致病性,而后者基本上无法通过生物信息学网站分析得到,这就需要阅读大量的文献以获得更完整的信息。5蛋白质组学研究蛋白质组学的应用为医学、生命科学等研究领域提供了新的思路,并且带来了较为丰硕的结果。如在癌症研究方面,不仅发现了组织蛋白酶B、热激蛋白27、mRNA连接蛋白P62等与癌变有关的蛋白,应用蛋白质组学技术还可能实现癌症的早期诊断。在致病微生物方面同样硕果累累。应用蛋白质组学研究猪链球菌时发现了烯醇酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、半胱氨酸蛋白酶,这些蛋白都与2型猪链球菌的致病性紧密相关,被认为是潜在的致病因子。蛋白质组学的应用可以实现高通量、高效率地对样品进行分析,并可以同时得到多个重要的研究结果。6回复突变体的质谱鉴定近几年发展起来的iTRAQ技术可能促使比较蛋白质组学升级发展成为定量蛋白质组学。该技术是在iCAT技术基础上发展起来的。iTRAQ技术采用4种相对分子质量均为145的等量异位标签,每个标签分子分别由相对分子质量为114、115、116、117的报道基团,相对分子质量分别为31、30、29