细胞培养准备 细胞培养准备3培养用液配制

细胞培养准备3

培养用液配制2023/10/2712023/10/272细胞培养用液和培养基体外和体内细胞所需营养基本相同；培养用液：是指适应细胞在体外生存和生长的各种溶液；包括水、缓冲液、平衡盐溶液、血清以及消化液、pH调节液等。2023/10/2722023/10/273水水是一种良好的溶媒。营养物质只有溶于水=>吸收；代谢产物也需溶于水=>排泄。水的比热高、潜热大=>调节温度水中有溶解氧的存在=>供细胞呼吸水有一定的表面张力=>对生物形态的保持也有一定作用.对于维持细胞的渗透压、酸碱平衡及生化反应极其重要。2023/10/2732023/10/2742023/10/2742023/10/275对细胞培养用水的要求杂质少、纯度高，安全可靠。一般在电导仪上表示200-300万Ω以上方可使用，生长液要在500万Ω以上。因此：必须经过2-3次玻璃/石英器皿蒸馏（金属蒸馏器蒸出的水含金属离子

）或者用离子交换树脂处理的水（超纯水）。

去离子水：含有非离子物质和有机物；2023/10/275不能用2023/10/276缓冲液由缓冲剂配制而成的混合溶液，当加入一定量的酸或碱时，其pH基本不变，这种溶液称为缓冲液。缓冲剂的组成：弱酸/弱碱及其盐如碳酸/碳酸氢钠；磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液只强调缓解pH变化；不强调渗透压2023/10/2762023/10/277生理盐水和平衡盐溶液生理盐水：常指渗透压与人体和动物体血浆相等的氯化钠溶液。常用浓度为0.9%平衡盐溶液：BSS，无机盐和葡萄糖组成细胞培养中常用的基本液体作用维持细胞渗透压；提供细胞生存所需能量，细胞代谢所需水分和无机离子提供缓冲系统，调节酸碱度。2023/10/2772023/10/278通常在平衡盐溶液中加入0.001%-0.005%的酚红pH6.5黄pH7.0橙pH7.4红pH7.6蓝红pH7.8紫

配液时的注意事项（1）称量要准确（2）物质的纯度:一级GR或二级AR（3）物质的可溶性:含钙、镁的物质单独溶解（4）配好后，无浑浊和沉淀的桃红色溶液2023/10/2782023/10/279无钙镁的平衡盐溶液（BSS)PBSD-Hank’s2023/10/2792023/10/27102023/10/27消化分离组织剪切成较小团块（或糊状）；进一步使细胞间的桥连结构松动使团块膨松使细胞团块充分分散；接种培养，细胞容易贴壁生长。

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酶的生化作用

非酶的化学作用少量细胞团和大量单个细胞的悬液细胞消化液2023/10/2711常用消化液胰蛋白酶溶液常用浓度：为0.25%和0.125%；作用条件：37度，pH8.0时消化能力最强；影响条件：Ca2+、Mg2+和血清存在降低酶活性所以,配制时，无Ca2+、Mg2+和血清存在。D-Hank’s2023/10/2711来源：胰脏制品作用：水解蛋白质2023/10/27122023/10/271胰蛋白酶消化分离法原理：使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。与赖氨酸或精氨酸的羧基相连接的肽键2023/10/27132023/10/27影响胰蛋白酶作用的主要因素细胞类型：难易程度有别酶的活力：新配活力高酶的浓度：通常0.25%温度：37pH:8无机盐离子：钙、镁、血清抑制消化时间温度低、组织块大、酶浓度低=消化时间长2023/10/27142023/10/27胶原酶(Collagenase)消化法来源：是一种从细菌中提取出来的酶作用：对胶原有很强的消化作用。对象：适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织。价格：贵方法：与胰蛋白酶相似2023/10/27152023/10/272023/10/2716乙二胺四乙酸二钠（EDTA.2Na)溶液是一种螯合剂，毒性小，便宜，易配制；配制时，无Ca2+、Mg2+。D-Hank’s高压灭菌，4度保存可与胰蛋白酶混合使用，效果更好；比例1:2/2:1注意：不受血清抑制，消化后彻底清洗，否则细胞易脱壁，影响细胞生长。2023/10/27162023/10/27172023/10/27作用对象：上皮组织分散效果好；原理：与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物利用结合后的机械力使细胞变圆而分散或使贴壁细胞脱离瓶壁。2023/10/2718抗生素溶液通常配制成1000倍母液工作浓度：青霉素（100U/ml)链霉素(100U/ml)卡那霉素(50U/ml)2023/10/27181mL培养基中加母液1uL★2023/10/2719细胞培养液一、培养细胞的生长条件（一）细胞的营养需要1、基本营养物质包括糖类、氨基酸(12种)、无机盐、维生素、微量元素等；2023/10/27192023/10/2720糖能量的主要来源；维持渗透压；是合成氨基酸的原料。是合成蛋白质和核酸所需的碳源；2023/10/27202023/10/2721氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位（1）12种基本氨基酸：精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、胱氨酸及酪氨酸。（2）有时细胞培养还加以下7种氨基酸，即天门冬氨酸、天门冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸。2023/10/27212023/10/2722谷氨酰胺（3）谷氨酰胺对细胞具有特殊作用:1、转氨基：天门冬氨酸、天门冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸；2、合成嘌呤、嘧啶，利于细胞代谢；3、是合成ATP的必须物；4、促进各种氨基酸进入细胞。2023/10/27222023/10/2723维生素(1)酶的辅酶和辅基的组成部分,对细胞的代谢有重大的影响，某些维生素缺乏，短期可引起细胞死亡。如生物素、叶酸、胭酰胺、泛酸、吡多醇、核黄素、硫胺素及B12等。(2)维生素C:氧化还原剂，利于细胞生物氧化

脂溶性维生素对细胞生长也有作用，它们常从血清中得到补充。2023/10/27232023/10/2724无机离子和微量元素(1)钠：维持渗透压增加细胞的应激性与细胞膜的渗透性利于细胞内外物质的转运。(2)钾：是激活细胞内某些酶所必需的。缺钾细胞变圆，胞质内颗粒增加，并产生一种特殊的树枝形细胞，24小时后细胞脱落死亡。2023/10/27242023/10/2725(3)钙：维持细胞膜的坚固和渗透性；保持神经和肌肉组织的正常兴奋性；许多酶必须有钙的存在才有活性；对粘着性和贴壁能力也很重要。(4)镁：是糖代谢某些酶系统的参加者。对细胞的贴壁也有重要作用。2023/10/27252023/10/2726(5)磷：磷酸盐是细胞和细胞间液的组成成分；参与蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素代谢；是能量物质ATP必不可缺的成分；对维持组织内的酸碱平衡起着重要作用。(6)碳：重碳酸盐与CO2对细胞生长和增殖很重要。糖分解以利细胞生长；可维持和调节培养基的pH。(7)微量元素:铁、锌、硒等对维持细胞的正常生理功能也同样起着重要作用。2023/10/27262023/10/27272023/10/27272023/10/27282023/10/27282023/10/27292023/10/27292023/10/2730培养基天然培养基最初培养细胞时，用天然培养基营养丰富成分复杂、来源有限包括血清、血浆、水解乳蛋白等目前与合成培养基配合使用2023/10/27302023/10/2731血浆目前较少使用；常用1年左右公鸡血浆；肝素抗凝，无菌操作；3000-4000rpm2023/10/27312023/10/2732血清与血浆成分区别？是天然培养基中最有效和最常用养分2023/10/27322023/10/2733血清对细胞的作用提供细胞增殖所必须的生长因子A因子促进细胞生长；D因子促进细胞粘连对细胞附壁有利保护作用：解除毒性物质对细胞毒性作用免受冻存、搅拌损伤其他：利于染色体良好分布2023/10/27332023/10/2734不利血清中存在不利于细胞生长和繁殖的物质例如：补体、免疫球蛋白补体灭活：56度30min成分复杂，不利实验结果分析年龄、个体、状态等因素影响培养稳定性重要的污染来源（支原体）2023/10/27342023/10/2735血清的质量要求外观：澄清、透明、淡黄色、无溶血、无杂质无：菌、支原体、内毒素总蛋白含量：35~45g/L球蛋白含量：20g/L，越低越好2023/10/27352023/10/2736血清使用注意事项购买血清，观察颜色、清亮度、沉淀；血清冻融后，上层无色透明，活力差，使用前如何处理？反复冻融，效价降低，那怎么办？长期冻存，有沉淀，抑制生长，扔掉吗？不同批号，质量存在差异，实验时怎么办？2023/10/27362023/10/2737血清种类和来源马、兔、鸡、小牛、新生小牛(出生后10天内）和胎牛（200天后）胎牛血清质量最好，价格最贵；血清制备采血：无菌操作，皮毛新洁尔灭、碘酒、酒精消毒，采血部位不能碘酒消毒？试管/瓶倾斜室温放置2-4hr，4度冰箱过夜；3000-4000rpm,离心10min，分装，使用前灭活.2023/10/27372023/10/2738水解乳蛋白(hydrolyticalbumin)制备：乳蛋白经蛋白酶和肽酶水解而得；常用浓度：0.2%～0.5%，平衡盐溶液配制。0.4%水解乳蛋白分解后几乎与人血浆中氨基酸成分相当。2023/10/27382023/10/2739酵母浸出液含丰富的维生素，利于细胞的生长。常用浓度为0.1%。鸡胚浸出液鼠尾胶原胰酶消化牛心肌浸液2023/10/27392023/10/2740人工合成培养基成分氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及一些辅助物质。氨基酸:主要是必需氨基酸,一般仅能利用L-型氨基酸谷氨酰胺：不稳定，易降解，单独配制，-20度保存，用时添加；2023/10/27402023/10/2741种类：MEM:最低必需培养液DMEM培养液:高糖（G:4500mg/L）：适用生长快、附着差的肿瘤细胞和神经细胞等低糖型（1000mg/L）RPMI-1640:适用多种细胞，包括正常和肿瘤细胞199:培养鸡胚细胞HAMF-12：适合单细胞培养和克隆化培养2023/10/27412023/10/2742优点：成分已知，培养条件一致;有利于定量研究代谢成分;可延长培养时间，节省人力、物力;无潜在病毒污染便于大量生产细胞使用：不同的细胞类型选择适合的培养基

已建系的细胞考虑建系过程中使用的培养基新建细胞系比较、选择不同的培养基2023/10/27422023/10/2743市售商品培养基的配制溶于2/3三蒸水，包装袋洗2次，充分溶解；补充碳酸氢钠和谷氨酰胺（据需要）；调节pH，过滤除菌，分装；用前，加抗生素和血清；注意调pH的HCl和NaOH，需三蒸水配制；各种器皿无菌；新培养基实验后再用；避免存放时间过长。2023/10/27432023/10/2744无血清培养基血清成分复杂

有益：生长、分裂、贴壁

有害：细胞毒性、抑制生长

未知成分：影响实验结果有些实验选择无血清培养基无血清培养基缺点成本高、价格贵细胞生长慢缺少通用的无血清培养基

一种无血清培养基只适用一种细胞2023/10/27442023/10/2745无血清培养基配制基础培养液

通常HamF-12/DMEM1:1混合补加15mmol/LHEPES,1.2g/LNaHCO3辅加成分培养基质:帮助细胞贴壁纤粘连蛋白：PBS配成25～50μg/ml层粘连蛋白：PBS配成l～5pg/ml多聚赖氨酸：