第五章细胞工程制药

第五章细胞工程制药第一节细胞融合与单克隆抗体生产制备技术第二节动物细胞工程制药第三节植物细胞工程制药第四节微生物细胞工程制药第五节生物反应器第一节细胞融合与单克隆抗体生产制备技术

一、B淋巴细胞杂交瘤技术二、单克隆抗体的制备三、人单克隆抗体1975年首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体随基因工程抗体技术相继出现的单域抗体、单链抗体、嵌合抗体、重构抗体、双功能抗体一、B淋巴细胞杂交瘤技术细胞克隆抗原物质通常具有多个不同结构的抗原决定簇，能刺激多个B细胞克隆产生反应每一个B细胞克隆只能产生针对单一抗原决定簇的复数个抗体，但这些抗体对同一抗原决定簇又有着不同的亲和性；即使抗原含有单一决定簇，仍能刺激多个B细胞克隆产生反应用某种抗原使动物免疫得到的抗血清中的抗体是来自多克隆的，是复杂的混合物。要从抗血清中分离、精制某特定的单一抗体是极其困难的一、B淋巴细胞杂交瘤技术

Burnet提出的克隆选择理论假定一种浆细胞只产生1种类型的免疫球蛋白分子，从一个单克隆细胞产生的抗体分子就是单克隆的。这些抗体具有特异性、同质性，称为单克隆抗体（McAb）1975G.Kohler和C.Milstein在细胞融合技术的基础上创立了淋巴细胞杂交瘤技术，第一次成功获得单克隆抗体以骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合所产生的杂交瘤细胞分泌抗体，就是B淋巴细胞杂交瘤技术或称单克隆抗体技术单克隆抗体的特点和应用单克隆抗体的特点：高度特异性；高度稳定性；高抗体活性；不可知性；过于单一性单克隆抗体的应用免疫学、细菌学、遗传学、肿瘤学、临床诊断(鉴别细胞分化类型与成熟程度、同位素标记对肿瘤细胞进行追踪、定位)、肿瘤的靶向治疗（生物导弹），存在问题包括一些肿瘤缺少很特异的标记物、一些原发瘤标记物发生改变、单克隆抗体的人源化问题McAb技术生产各种疫苗（成本低又安全）二、单克隆抗体的制备骨髓瘤细胞株的选择与培养免疫脾细胞的选择与培养细胞融合杂交瘤细胞的选择杂交瘤细胞克隆化杂交瘤细胞抗体性状的鉴定骨髓瘤细胞株的选择与培养（1）骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体（2）选择缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的骨髓瘤细胞选择对数生长期细胞：将骨髓瘤细胞株在融合前1周转移到含10%小牛血清的RPMI1640培养基或DMEM培养基上传代(2-3代)，融合的前一天换液培养，使融合时细胞处于对数生长期（活细胞>95%)，保持细胞浓度不超过1x106个/mL,制备细胞悬浮液免疫脾细胞的选择与培养（1）所选的免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近亲缘关系，一般采用与骨髓瘤供品系一致的动物如BALB/C系小白鼠的淋巴细胞与同种白鼠的骨髓瘤细胞融合，所得杂交瘤细胞的染色体稳定，也能较理想的分泌目的抗体（2）所选的动物品系对抗原免疫应答要强细胞融合（1）细胞融合剂：40-50%的PEG4000，可在PEG溶液中加入DMSO（2）操作步骤：

A、培养后的骨髓瘤(NS-1株)和脾细胞悬液，分别用无血清RPMI1640培养基洗两次后，进行活细胞计数

B、在室温条件下脾细胞：NS-1细胞以2x108:2x107比例在离心管中混合，然后离心（1000r/min）10min。

C、去上清液，轻叩离心管使细胞散开，用吸管滴入0.5mL50%的PEG，用吸管尖轻轻搅拌细胞融合D、每隔0.5-1min,滴加1mL(37℃水浴预热)无血清培养液，每次加后旋转或轻搅拌，把细胞沉淀体变成匀质的悬浮液，尽可能增加细胞接触PEG的机会

E、融合过程不超过7min(滴加10次培养液)，离心去上清，加入培养基（含10%小牛血清）20mL悬浮，离心10min，去上清

F、含10%小牛血清的培养基洗两次后再悬浮，并在CO2培养箱内37℃培养过夜杂交瘤细胞的选择

未融合的细胞比杂交瘤细胞增殖更快，应将融合后的细胞立即转入选择培养基中

HAT培养基：培养基中加入次黄嘌呤、胸腺嘧啶和氨基蝶呤骨髓瘤细胞脾细胞(体外不能长期存活也不能增殖)杂交瘤细胞选择操作方法如下：上述培养过夜的细胞混合物，离心，去上清用20mL的HAT-10%小牛血清RPMI1640培养液悬浮悬浮液分注于96孔培养板，CO2培养箱内37℃培养第1周每3天、第2周每2天换液（HAT培养液）1次，培养第2天培养液变黄立即换液从第3周改换HT-10%小牛血清RPMI1640培养液;从第四周起换含10%小牛血清RPMI1640培养液ELISA检测各孔培养的上清液，发现目的抗体阳性孔时，将细胞转移至24孔培养板继续扩大培养微量、快速、特异、敏感、简便、高通量酶联免疫技术、免疫荧光技术、放射性免疫技术杂交瘤细胞选择过程流程图杂交瘤细细的克隆化：

单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程，集团内每个细胞的生物学特性和功能完全相同多数情况下初选的阳性克隆中不是来自单个细胞，可能混有不分泌目的抗体的克隆（长的快）或遗传不稳定的杂交瘤细胞。为避免发生竞争性生长抑制，或发生变异不再产生抗体，以保证分泌性克隆生长的稳定性，需要再进行3-4克隆化克隆培养方法：软琼脂法、有限稀释法杂交瘤细胞抗体性状的鉴定

（1）杂交瘤细胞的鉴定：染色体检查分析（数目、形态）：染色体40+（54-64）；结构上除多数为端着丝点外，还出现少数中部或亚中部着丝点的标志染色体；染色体数目较多且比较集中的杂交瘤细胞能稳定分泌高效价的抗体细菌、霉菌、支原体检查

杂交瘤细胞抗体性状的鉴定（2）单克隆抗体的鉴定：抗体的特异性和交叉情况；抗体的类型和亚类；抗体的中和活性；抗体的亲和力；抗体对应抗原的分子量；抗体识别的抗原表位单克隆抗体的大量制备：

动物体内诱生法、体外培养法（1）动物体内诱生法注入细胞的前几周，进行同种小鼠腹腔注射刺激性有机溶剂降脂烷或液体石蜡，破坏腹腔内膜，建立杂交瘤细胞易于增殖的环境在接种杂交瘤细胞前1-2周，给小鼠注入0.5mL的异十八烷或液体石蜡，接种后1-2周开始取腹水（每次3-5mL），抽取几次，在动物临死前隔日取腹水1次，可达10mL.

优点：操作简便、经济、单克隆抗体量多且效价高、有效的保存杂交细胞瘤缺点：腹水中杂蛋白，难于纯化；消耗大量活鼠。单克隆抗体的大量制备：体外培养法新获得的杂交瘤细胞很不耐受稀释，培养物逐步扩大A、含10%-20%胎牛或小牛血清的RPMI1640培养液：感染、纯化难、批间差异大B、无血清培养C、微囊技术：培养完成后，收集发酵液，肝素处理，然后离心并分别收获抗体（浓度达40-50%）和杂交瘤细胞（后者可在其他微囊中重新培养）评价体内与体外培养、微囊法三、人克隆化抗体鼠源单克隆抗体：人抗鼠抗体反应（HAMA）；种属不同的致敏反应人肺癌单克隆抗体LC-1存在问题：（1）致敏问题；体外免疫法效果差：人的外周血有大量T淋巴细胞的抑制细胞，B淋巴细胞又处在不同的分化阶段。（2）杂交瘤细胞不稳定（3）转化细胞不稳定（4）抗体的生产问题（5）人-鼠杂交瘤细胞人克隆化抗体由于人-人杂交瘤接种于动物遭到强烈的种间排斥，迫切需要解决无血清体外培养基因工程抗体解决：降低鼠源性单克隆抗体分子的免疫原性降低抗体的相对分子质量，以增加组织的透过性，如单链抗体、单域抗体第二节、动物细胞工程一、动物细胞工程的类别二、动物细胞工程的特性三、动物细胞的培养基四、动物细胞的培养技术五、动物细胞的种质保存技术六、动物细胞融合技术七、动物细胞单克隆抗体技术（略）八、动物细胞大规模生产技术九、动物细胞实例一、动物细胞工程的类别1、人工授精2、胚胎移植3、体外受精4、哺乳动物孤雌生殖5、嵌合体技术6、性别选择7、细胞融合8、染色体重组和改造一、动物细胞工程的类别9、基因及细胞器的转移10、细胞大规模培养11、动物细胞反应器12、动物细胞反应动力学13、单克隆抗体技术二、动物细胞工程的特性1、细胞生长缓慢，易受杂菌污染，培养时需要加抗生素。2、动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力较差。3、培养过程中需氧量少，不耐受强力通风和搅拌。4、动物细胞在培养过程中常常相互粘连，具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性。5、培养产物多是分布于细胞内外，培养过程成本较高。二、动物细胞工程的特性6、大规模培养时，不可套用微生物的培养技术。7、原代细胞在进行继代操作时，一般于50代后就告退化死亡。8、动物细胞工程的无菌特性（下面讲解）动物细胞工程的无菌特性消毒要求---高压蒸汽消毒，干燥高温消毒，紫外线,化学方法,过滤除菌等：（1）高压蒸汽消毒：依赖湿热而非高压消毒，常用121度，15—20分钟（2）干燥高温消毒：160度，90分钟（3）紫外线：直接照射，但注意会产生臭氧，并对身体有害。（4）消毒剂：新洁而灭、70％酒精、过氧乙酸（5）过滤除菌：血清、合成培养液、酶液等含有蛋白质，具有生物活性，不能采用高温、高压消毒的方法进行灭菌，因此须采用过滤除菌。三、动物细胞的培养基动物细胞的培养基组成----氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素、缓冲系统。1、培养细胞的生存环境2、培养液要求3、平衡盐溶液（BSS）4、天然培养基5、合成培养基6、无血清培养基1、培养细胞的生存环境适宜的温度----人和哺乳动物培养细胞最适温度均为35－37℃。气体环境和氢离子浓度----需要一定量的O2（1995－9975pa）和CO2（95％空气+5%CO2）；pH7.2-7.4营养物质----适当的培养基环境无毒和无菌渗透压2、培养液要求氨基酸---氮源盐类---钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，氯离子，硫酸根离子，磷酸根离子，碳酸氢根离子等葡萄糖：供能缓冲系统---CO2缓冲系统或HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）生长因子---PDGF，EGF，FGF等其它成分---维生素，矿物，有机补充物，激素等3、平衡盐溶液（BSS）

功效：①维持渗透压②提供缓冲系统③提供水分和无机盐4、天然培养基天然培养基如----血清，血浆，组织浸出液等优点----营养成分丰富，培养效果好缺点----来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染天然培养基的类型：[A]乳蛋白水解物培养基[B]酪蛋白水解物培养基[C]血清及胚胎浸出液培养基5、合成培养基合成培养基--是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。优点--标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点--缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。目前常用合成培养基＋血清来培养细胞5、合成培养基合成培养基的类型：（A）Eagle培养基（内含13种氨基酸、9种维生素、多种无机盐）（B）Ham氏F10培养基（内含20种氨基酸、多种维生素、10种无机盐）（C）TC199培养基（D）Waymouth氏MB752/1培养基（E）NCTC109培养基6、无血清培养基无血清培养基----在合成培养基中加入起血清作用的种类激素和生长因子，如铁转运蛋白、乙醇胺、胰岛素、硒、氢化可的松、维生素C、促胃激素等等。血清的成分：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分四、动物细胞的培养技术（一）动物细胞培养的基本概念（二）可供进行动物细胞培养的材料（三）动物组织块培养法（四）动物细胞单层培养法（五）单细胞分离培养（六）单细胞微量板克隆技术（七）二倍体细胞培养（八）传代细胞株的培养（一）动物细胞培养的基本概念1、动物细胞培养的定义2、动物细胞培养的历史3、动物细胞培养的优点4、动物细胞培养的类别5、培养细胞的特性6、动物细胞培养所需仪器设备1、动物细胞培养的定义

动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。2、动物细胞培养的历史（1）开始----1907，Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液内，培养出神经元。（2）成熟----以人的肿瘤细胞与组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系。3、动物细胞培养的优点（1）

细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。（2）理化环境可控制，培养物可直接被观测。（3）提供大量均一的细胞供制备用。（4）便于进行人工筛选。（5）结合显微电影技术，可观察细胞代谢活动和反应。目前，动物细胞培养技术已经广泛应用于病毒学，免疫学，遗传学，肿瘤学，分化及发育，细胞毒理试验，生物技术等各个领域。4、动物细胞培养的类别1、动物组织培养2、动物细胞培养（1）细胞团块单层培养（2）单细胞克隆株培养3、原代细胞培养（1）初代培养（2）细胞株确立培养4、细胞继代培养5、转化细胞的培养6、工程细胞系的培养5、培养细胞的特性悬浮型--悬浮在溶液中贴壁型：[A]上皮细胞型[B]成纤维细胞型[C]游走细胞型[D]多形细胞形（1）动物细胞贴壁生长特性（2）动物细胞接触抑制特性（3）动物细胞培养一代生长过程（1）动物细胞贴壁生长特性（2）动物细胞接触抑制特性细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。（3）动物细胞培养一代生长过程（1）游离期（2）指数生长期（3）稳定期（4）衰退期6、动物细胞培养所需仪器设备实验室要求（A）和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等，入内换上。（B）室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥.万级。（C）侧部可设传递窗，用于物品传递。（D）有消毒用紫外线灯（1）培养器具（2）超净工作台（3）CO2培养箱（4）倒置显微镜（5）纯化水装置（1）培养器具培养瓶培养板培养皿（2）超净工作台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。100级超净工作台指标：（≥0.5цm≤3.5粒/L）

（3）CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。二氧化碳的作用：维持PH值。（4）倒置显微镜

（5）纯化水装置（二）可供进行动物细胞培养的材料1、胚胎组织------如10—20日龄的鸡胚、实验动物胚胎、人工流产的胎儿。胚胎组织的细胞由于互相之间粘连作用较弱、易于消化和分散、并且其细胞生命力强，易于培养和增殖。2、成体组织------如肝脏、脾脏、心脏、肾脏、白血球等等，由于其细胞之间具有较强的粘合作用，培养难度较大。3、肿瘤组织-----细胞增殖能力强，可在体外长期培养和繁殖，并且可以采用微生物培养方法进行悬浮培养。（三）动物组织块培养法将动物组织切成直径为1—2mm的小块、并且进行培养的方法称为动物组织块培养法。有些动物组织如人的皮肤细胞，由于分散成细胞十分困难，因此常常采用组织块培养法。动物组织块培养法又可分为三种不同的培养方法：

（1）血浆凝固培养法

（2）胶原固着培养法

（3）无基质固着培养法动物组织块固着之后，加培养液，于37℃、CO2培养箱中、通入含5%CO2的空气进行培养，即可在组织块周围长出新的细胞单层。动物组织培养过程中，进行旋转或者振荡，培养效果更好。（四）动物细胞单层培养法动物组织块经过消化分散成单细胞或者细胞团块之后，粘附于培养基中，培养成新生细胞单层的方法称为动物细胞单层培养法。动物细胞单层培养法包括二个过程：1、组织块分散成单细胞2、细胞培养1、组织块分散成单细胞消化分散组织块的方法分为三种：（1）酶消化法（2）物理分散法（3）酶消化与物理分散结合法

（1）酶消化法将组织块切成1-2mm的立方小块，置蛋白酶溶液中进行消化分散，离心收集细胞，经过平衡盐溶液洗涤，加培养基后于4℃条件下贮存备用。消化用的蛋白酶有：A、胰蛋白酶----适用于大多数组织块的消化，对组织块的使用浓度为0.25%、对继代细胞的浓度为0.1-0.25%，残留的酶液对细胞有一定的毒害作用。小牛血清常常对细胞有保护作用。B、链霉蛋白酶----适用于分散多种组织块，分散较为彻底，分散后的细胞不含团块。但是酶残留对细胞的毒性较大，并且小牛血清细胞没有保护作用。C、胶原酶----适用于分散肝脏、心脏等含有胶原组织的细胞分散，对于细胞的毒性小，可用于克隆培养。若与胰蛋白合用，则分散效果更好。（2）物理分散法本法是将组织小块通过加压过筛的方法进行机械分散，其结果会形成单个细胞和细胞团块，其优点是细胞不受化学物质的影响，其缺点是细胞损伤率较大，不宜用来分散胚胎组织。（3）酶消化与物理分散结合法本法是指动物组织先经过酶消化，再用电磁搅拌的方法进行物理分散。组织小块经酶消化5-10分钟之后，立即用电磁搅拌器在200转/分钟进行物理分散，每消化一次就收集一次细胞悬液，余下的组织块再依次进行消化分散，直至消化完全，最后离心收集细胞，洗涤除去酶液，加培养基于4℃条件下贮存备用。2、细胞培养上述细胞悬液经过计数、稀释之后，接种于无菌培养器中，加入培养液于37℃条件下培养，细胞即粘于瓶底或者转瓶内壁，并且开始生长形成单层。接种浓度：

上皮细胞1*105—3*105个/毫升。

成纤维细胞2*105—6*105个/毫升。

成体细胞应高于胚胎细胞。培养时间：

上皮细胞5—7天形成单层。成纤维细胞3—4天形成单层。培养条件：

动物细胞的需氧量较低，一般通入含5%CO2的空气进行供氧，有利于维持培养基的PH值。培养方法（1）原代培养（2）传代培养（1）原代培养定义：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续1－4周。步骤：取材---组织分离---培养（2）传代培养定义：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。注意：原代细胞类型不一，利用不同的消化时间和消化液。步骤：[A]贴壁细胞：去除培养基---胰蛋白酶消化---加入培养液，形成细胞悬液---稀释---培养[B]悬浮细胞：收集细胞悬液---离心搜集细胞---用培养液稀释---培养（五）单细胞分离培养单细胞分离培养也称为细胞克隆培养，是指将单个细胞培养成纯细胞系群的技术。由于动物细胞具有集群效应，单个细胞在培养基中难以生长。因此在克隆株培养过程中，常常采用：（1）使用条件培养基进行培养。（2）在培养基中加入饲养细胞----如加入小鼠胸腺细胞和小鼠腹腔巨噬细胞。（六）单细胞微量板克隆技术1、微量板克隆技术2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用1、微量板克隆技术微量板是指孔径为6mm，容量为0.3ml的多孔培养板。常用的有96孔、55孔、24孔。细胞克隆时，将细胞稀释成10个/毫升以下的悬浮液，然后向每1微孔中加入0.1毫升，则每1孔中的细胞数平均为1个。接种后在含5%CO2的空气的培养箱中进行培养，每隔4—8天更换一次新的培养液0.2ml，直到形成单克隆细胞株。继代培养时，吸除培养液，用不含Ca、Mg的平衡盐溶液冲洗，再用胰蛋白酶进行消化，然后用培养液洗涤，再转移到25cm2表面的培养瓶中，加3ml培养液进行培养，几天后就会长成成片的新克隆细胞。2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用微量板细胞克隆过程中，由于每一个克隆肯定来源于同一个细胞，其培养的重复性和可靠性均十分良好。微量板细胞克隆技术可用于建立纯细胞株、检查细胞遗传性的一致性，还可用于分离细胞变种。微量板细胞克隆技术在评价药物、毒物对细胞生长的影响、筛选淋巴细胞杂交瘤工程、基因和细胞工程、制备单克隆抗体工程中具有重要作用。（七）二倍体细胞培养1、二倍体细胞的培养意义2、二倍体细胞的来源3、二倍体细胞的培养特征1、二倍体细胞的培养意义二倍体细胞：（1）具有二倍性染色体（2n），染色体核型正常。（2）培养条件下只具有有限的生命力，不能进行无限期的分裂繁殖。（3）无致癌性。培养意义：二倍体细胞保留着所在组织正常的细胞性状。（1）可用于生产疫苗、尿激酶、干扰素等药物的生产。（2）也可用于细胞遗传学、细胞分化及衰老的研究、以及药物的细胞毒性、环境污染的细胞学检测2、二倍体细胞的来源来源于3-4个月的胚胎肺组织。目前已获得了多种人胚肺二倍体细胞，如：W1-38 MRC-5 MRC-9IMR-90 2BS KBM-13LS-7

3、二倍体细胞的培养特征影响二倍体细胞培养的因素有：（1）分种率-----一般不超过1：8，细胞密度应大于104个/平方厘米，否则死亡率大，细胞难以成层。（2）继代寿命----细胞在生长到2/3PD时就应该进行继代培养，否则细胞容易退化、衰老和死亡。（3）PH值----应大于7.2，最好通过CO2培养箱和有机缓冲液如HEPES来稳定培养液的PH值。（八）传代细胞株的培养1、传代细胞株的定义2、传代细胞株的条件3、传代细胞株的建立4、已经获得确认的细胞株1、传代细胞培养的定义正常细胞在继代过程中，有些细胞的增殖力会突然增强，在特定条件下可以无限繁殖。同时与原代细胞相比，其形态、生理生化特性、病毒敏感性、抗原性、以及染色体的结构上均发生了变化，并且具有致癌性。这类细胞就称为传代细胞。确立细胞株的培养也称传代细胞培养。传代细胞不具有锚定依赖性、接触抑制性和群体效应。同时也丧失了组织分化能力和脏器特异性。仅保留了种属特异性。2、传代细胞株的条件3、传代细胞株的建立（1）细胞系---原代培养物首次传代成功后即成细胞系。[A]有限细胞系[B]连续细胞系（2）细胞株---通过选择从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物。4、已经获得确认的细胞株

国际和国内被命名的细胞系和细胞株都是一些形态比较均一、生长状态比较稳定和生物性状相对清楚的细胞群。目前已经获得的确立细胞株有：[A]小鼠成纤维细胞（L-细胞）[B]人体子宫癌细胞（Hela-细胞）[C]肝癌细胞（BEL-细胞）[D]小鼠及人体骨髓瘤细胞4、已经获得确认的细胞株五、动物细胞的种质保存技术1、种质保存的必要性（1）动物细胞在连续的继代培养中，容易污染和产生多种细胞混杂。（2）细胞株在继代培养过程中常常发生变异。（3）二倍体细胞存在寿命限制，无法进行大多的传代培养。2、保存形式（1）组织块（2）细胞悬浮物（3）细胞单层培养物3、保存方法4、超低温泠冻技术3、保存方法（1）常温法----将特定的动物细胞于20--30℃下进行保存的方法。

如人羊膜细胞单层于28℃下可保存1个月。

人肾细胞单层于25--30℃下可保存1个月以上。

人二倍体细胞单层可保存二周，中间换液则可保存30天以上，（2）低温法----将特定的动物细胞于4℃下进行保存的方法。

如人胚组织块于4℃下可保存14—30天。（3）超低温泠冻法----将特定的动物细胞于-70℃以下、或者在液氮中进行保存的方法。超低温泠冻法可以长期保存动物细胞，如二倍体细胞2BS自1973年来保存至今，其遗传性仍然没有变化。4、超低温泠冻技术（1）防冻剂准备（2）超低温泠冻的具体方法（3）超低温泠冻后的解冻方法

（1）防冻剂准备

超低温泠冻法需要使用防冻剂，以减少细胞在冻结过程中所受到的损伤。常用的防冻保护剂有：甘油、DMSO。A、甘油----毒性较小，能够结合水，减少组织结冰量，防止细胞内盐浓度升高，具有保护细胞的作用。其使用浓度一般为5—20%。B、DMSO----是目前应用较多的一种保护剂，使用浓度为5-12.5%，与甘油相比，DMSO的毒性更低、抗冻能力更强。（2）超低温泠冻的具体方法

先配制8-10%的DMSO+15-20%的小牛血清+适量NaHCO3的保护液

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将细胞培养物消化、分散、离心，收集单细胞

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按5*106个/ml的浓度添加保护液，1ml/支分装于安瓿瓶中

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0-4℃放置2-4小时

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移至-70℃以下的冰箱中、或者在液氮中进行保存（3）超低温冷冻后的解冻方法将安瓿瓶取出，包裹4层纱布浸入40℃水中，振摇融化40秒

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混匀后立即接种到1-2瓶100ml的培养瓶中

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按1-2-4-8ml的方式依次加入生长液。最终加至20ml。注意事项[A]、保护液中含DMSO时，可直接用来接种。[B]、保护液含甘油时，应该离心除去甘油以防影响细胞增殖。六、动物细胞融合技术动物细胞融合技术----也称动物体细胞杂交技术，是指二个或者二个以上的动物细胞在外力作用下，合并为一个多核细胞的过程。细胞膜蛋白质重新分布是细胞融合的基础。（一）促融因素（二）完整细胞之间的融合（三）核体、胞质体与完整细胞之间的融合（四）微细胞与完整细胞之间的融合（五）脂质体介导的细胞融合（六）融合后杂种细胞的筛选技术（一）促融因素1、病毒诱导融合2、PEG诱导融合3、电场诱导融合4、其它诱导融合（1）聚乙烯醇（2）离心力1、病毒诱导融合某些不同种属的动物细胞在特定病毒、病毒外壳或者病毒碎片的作用下，可以发生融合作用。如仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱疹病毒等。当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病毒时，病毒或其组分会在细胞间起粘连作用而使细胞聚集成团，细胞膜上的蛋白质和脂质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。病毒所诱导的融合是随机的，无法人为控制，同时融合率较低。2、PEG诱导融合当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时，就会产生细胞聚集作用。在除去PEG的过程中，即产生细胞融合现象。所用的PEG分子量在1000-6000之间，一般浓度为40-50%，在37℃下作用2-3分钟，其促融效果最佳。PEG促融合的作用机理不清，其促融作用也具有随机性，无法人为控制。3、电场诱导融合将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电场作用时，细胞之间就会发生紧密接触，形成稳定的串珠状偶极子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就会发生膜击穿，不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融合，形成一个双核或者多核的细胞。一般来说，击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50微秒。电场诱导融合不损伤细胞，具有可人为操作的控制的特性，融合率较高。（二）完整细胞之间的融合取一定数量（107-108个/ml）的二种亲本细胞，充分混合

→离心，取下层细胞悬液0.1ml

→逐滴加入0.4ml、37℃、40%的PEG溶液，37℃静置90秒

→缓慢加入5-10ml无血清培养液，摇晃4-5次，离心，除去上清液

→每0.1ml细胞悬液加入25ml完全培养基，以每孔0.1ml分装于96孔培养板上。

→37℃下CO2培养箱中培养。（三）核体、胞质体与完整细胞之间融合具体过程分为二步：1、核体、胞质体的制备2、核体、胞质体与完整细胞之间的融合1、核体、胞质体的制备2、核体、胞质体与完整细胞之间的融合（1）按完整细胞的融合方式，可将核体与另一种完整细胞融合。（2）按完整细胞的融合方式，可将核体与另一种细胞的胞质体融合。（3）按完整细胞的融合方式，可将胞质体与另一种完整细胞融合。融合之后，能够改变细胞的遗传性状、传递耐药性以及雄性不育等性状。（四）微细胞与完整细胞之间的融合一个或者几个染色体外包裹一层细胞膜的小体，称为微细胞。微细胞的制备方式是：

用秋水仙素处理处于对数生长期的动物细胞，终止细胞分裂

→此时，细胞核分裂成若干个微核，每个微核由1个-数个染色体所组成。

→再用细胞松驰素B处理，使得微核脱离细胞膜

→按完整细胞的融合方式，可将微核与另一种完整细胞融合。

→所获得的融合子称为微细胞杂种细胞。（五）脂质体介导的细胞融合动物细胞破碎之后，经过差相离心，可分离出线粒体、溶酶体等细胞器，甚至于可分离出RNA、DNA、逆转录酶和其它大分子。

→将上述细胞器包装成脂质体

→按完整细胞的融合方式，可将脂质体与另一种完整细胞融合。

→可获得相应的杂种细胞1、通过转移细胞器获得的杂种细胞，可以获得抗药性和抗毒性遗传性状。2、生物大分子的转移，是细胞工程和基因工程的交汇点。（六）融合后杂种细胞的筛选技术筛选杂种细胞的目的是为了获得性能优良的杂合细胞。1、杂种细胞的筛选原理2、筛选系统1、杂种细胞的筛选原理将融合后的细胞混合物于选择性培养基上培养，终止那些同型多核、异型多核细胞以及未能发生融合的亲本细胞的生长繁殖，而仅仅允许异型双核细胞繁殖。（1）同型多核融合细胞----无法合成DNA，而失去繁殖能力。（2）异型多核融合细胞----细胞核不能进行再次分裂，也失去繁殖能力。2、筛选系统（1）HAT选择系统（2）抗药性选择系统（3）营养互补选择系统（4）原位杂交法（略）（5）基因探针选择法（略）（1）HAT选择系统正常的动物细胞，其DNA的合成途径有二条：全合成途径----利用外源性营养物合成DNA。这一途径能被氨基喋呤所阻断。补救合成途径----利用自身代谢产物中的游离嘌呤和嘧啶来合成。[A]、骨髓瘤细胞----骨髓瘤细胞能够在体外长期分裂繁殖，但是其DNA合成存在着缺陷。当培养基中含有氨基喋呤（A）时，骨髓瘤细胞就无法正常生长。HPRT-型骨髓瘤细胞----属于次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶缺陷型细胞，其嘌呤只能通过全合成途径进行合成。（1）HAT选择系统TK-型骨髓瘤细胞---属于胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型细胞，其嘧啶只能通过全合成途径进行合成。[B]、淋巴细胞----同时含有合成DNA的二条途径，但是不能够在体外长期分裂繁殖。在人工培养基中的存活时间只有1-2天。[C]、骨髓瘤细胞+淋巴细胞=杂交瘤细胞----既能够在体外长期分裂繁殖，又能够通过二条途径合成DNA，HAT是含有次黄嘌呤（H）+氨基喋呤（A）+胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基。因此在带有选择性的HAT培养基中，只有杂交瘤细胞才能正常存活。（2）抗药性选择系统利用生物细胞对于药物敏感性的差异程度，来筛选杂种细胞的方法，称为抗药性选择系统。一种亲本细胞M对药物A敏感、同时对药物B不敏感。另一种亲本细胞N对药物A不敏感、而对药物B敏感。M+N融合后的杂合细胞P同时对药物A、B均不敏感。那么，在同时含有药物A、药物B的选择性培养基中

（A）亲本细胞M不能生长

（B）亲本细胞N也不能生长

（C）只有杂合细胞P才能在选择性培养基中存活。这样，经过反复分离和继代移植，就可以筛选出杂种细胞。（3）营养互补选择系统生物细胞在缺乏某种营养成份时就不能生长，这种细胞称为营养缺陷型细胞。A亲本细胞为色氨酸缺陷型。B亲本细胞为苏氨酸缺陷型。A+B融合后的杂合细胞C则为非缺陷型。在同时不含色氨酸+苏氨酸的选择性培养基中。A、B亲本细胞均不能正常生长而只有A+B融合后的杂合细胞C才能存活七、动物细胞大规模生产技术动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下，高密度大批量培养有用的动物细胞以生产药品的技术（一）培养剂（二）培养技术（三）动物细胞工程制药基本过程（一）培养剂1、含小牛血清的培养基----在培养基中添加5-10%的小牛血清。2、不含小牛血清的培养基----具体有三种类型

（1）基本合成培养基

（2）基本合成培养基+生长因子

（3）基本合成培养基+组织抽提物起血清作用的各类生长因子----铁传递蛋白、乙醇胺、胰岛素、促胃酸激素、维生素C、可的松、硒等等成份。（二）培养技术1、细胞悬浮培养法2、固定化培养法3、微载体培养法

1、细胞悬浮培养法（1）细胞悬浮培养法的概念（2）细胞悬浮培养法的工艺流程（3）细胞悬浮培养法的注意事项（1）细胞悬浮培养法的概念细胞在培养液中呈现悬浮生长繁殖的方法称为细胞悬浮培养法。细胞悬浮培养法的具体方式有3种：批量法、半连续法、连续法。细胞悬浮培养法适用于培养传代细胞株、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液细胞和淋巴细胞。可用来大量生产疫苗、a-干扰素、白介素、淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体（McAb）。（2）细胞悬浮培养法的工艺流程由配料罐→培养液贮罐→平衡罐→前培养罐→主培养罐→培养液分离槽→离心→提取→干燥设备所组成。在配料罐内配制培养液，经过无菌过滤之后，送入培养液贮罐

→再次灭菌之后，送入平衡罐，调整氧化还原电位至70-100Mv，以提高细胞的生长繁殖速度

→送入前培养罐进行细胞增殖培养，再送入主培养罐生产和合成药物

→培养后的细胞悬液送入收集罐和分离槽→离心→提取→干燥设备（3）细胞悬浮培养法的注意事项A、在培养过程中，为了保证细胞处于单颗粒均匀悬浮状态，需要采用搅拌式反应器或者气升式反应器，以较低的搅拌速度，并以一定速度通入含水量5%CO2的无菌空气，来保证细胞处于悬浮状态，并维持培养液中一定的溶解氧。B、为了使细胞不至于产生凝聚、成团或者沉淀，在培养基的基础盐溶液中不加Ca和Mg。同时间歇式或者连续地更换部份培养液。C、在进行动物细胞培养过程中，随时检测和控制培养过程的温度、压力、溶解氧、CO2、PH值、氧化还原电位、搅拌速度、通气量、营养成份、（3）细胞悬浮培养法的注意事项D、细胞密度：在动物组织中的细胞密度为109个/ml，为自然界中的最高密度状态。体外悬浮细胞培养状态，细胞密度一般控制在5*106个/ml。在新颖的灌流培养系统中，细胞密度可达到107个/ml。2、固定化培养法（1）固定化培养法的定义（2）动物细胞的固定化培养方法（3）目前已经开发的固定化培养装置（4）中空纤维培养器（1）固定化培养法的定义将细胞限制或者定位于特定的空间位置的技术称为细胞固定化培养法。固定化培养有优点有：

A、细胞可维持在较小体积的培养液中生长。

B、对细胞的损伤程度较低。

C、易于更换培养液。

D、细胞和培养液容易分离。

E、培养液中产物浓度高。（2）动物细胞的固定化培养方法吸附法----所用载体有陶瓷颗粒、玻璃珠、硅胶颗粒、中空纤维膜、中空纤维培养器。包埋法----将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原、血纤维等海绵状基质之中。

（3）目前已经开发的固定化培养装置多层平板装置螺旋卷膜培养器多层托盘式培养器卷带式培养器中空纤维膜流化床式培养器中空纤维培养器（下面以此作为主要讲解内容）（4）中空纤维培养器[A]、结构----中空纤维培养器属于填充床式反应器，由培养器容器+供氧器+输液泵所组成，各部份之间由硅橡胶管连接成循环回路。[B]、原理：中空纤维培养器由中空纤维管所组成，其管壁是半透性的多孔膜，O2和CO2的进出通道位于纤维管内，它们能够自由透过膜进入反应器。培养液通路在纤维膜外表面与反应器内表面之间，大分子物质不能够自由透过纤维管壁。动物细胞则是贴附在中空纤维膜的外壁生长。（4）中空纤维培养器由于该装置内可装有上千根中空纤维管。因此其表面积可达到其容积的40倍，溶氧的传输速率也可达到0.6mmol/L*H，这种结构为大规模培养动物细胞提供了条件。[C]、操作过程----先将细胞接种于中空纤维外表面与反应器内表面之间。保温的培养液通过输液泵进入反应器。使细胞在流动着的培养基中生长。[D]、优点[D]、优点细胞生长密度高，可达108个/ml以上。细胞处于接近生理状态的理化梯度之中。营养物质可以有效地分布，代谢产物能够及时排出。细胞培养可达数月，易于实现连续培养。细胞分泌的蛋白质浓度高。产品纯度可高达60-90%。反应器体积较小。可培养多种细胞，有利于降低成本。3、微载体培养法（1）定义----将细胞吸附于微载体表面，再在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面生长成单层的方法称为微载体培养法。（2）微载体培养法的优点:兼有固定化培养和悬浮细胞培养的双重特点。在不增加培养罐体积的条件下就能增加动物细胞产量。便于对高水平系统进行检测与控制。（3）微载体培养法所用的材料（4）Cytodex-1微载体培养法的技术指标（3）微载体培养法所用的材料对细胞无毒、容易使细胞产生贴附，其密度大于1，微粒的直径为100-200um，可容纳几百个细胞。目前已经选用的材料有：

DEAE-Sephadex-A50 DEAE-Sephadex-A52

QAE-Sephadex 经处理的塑料尼龙 二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺

聚苯乙烯市场上出售的商品微粒有：

DEAE-交联葡聚糖（Cytodex-1，Superbeads）

二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺（Biocarrier）

聚苯乙烯（Biosilon）（4）Cytodex-1微载体培养法的技术指标干颗粒直径60-87um、在培养液中可膨胀成160-230um，每克微粒的表面积为0.6平方米，相当于7个标准转瓶（直径285mm*长度110mm）、采用培养罐进行培养。Cytodex-1的浓度为1mg/ml。相当于8000-9000粒/ml。其表面积为10cm2。细胞生长密度可达105个/ml。培养前24小时，将细胞贴附于载体上。培养液、葡萄糖、细胞同时加入培养罐中。（4）Cytodex-1微载体培养法的技术指标温度为37℃PH=7.2-7.3溶解氧为20%搅拌速度为60-75转/分钟。（三）动物细胞工程制药基本过程1.生产用动物细胞的获得：要求；获得；2、动物细胞大规模培养方法悬浮培养；贴壁培养；固定化培养3、培养的操作方式分批式培养、流加式培养、半连续培养、连续培养（三）动物细胞工程制药基本过程4、培养过程的调控细胞生长检测：细胞计数、细胞常规检查、微生物污染影响细胞培养的理化因素及其检测：温度、pH、溶氧的检测与控制、搅拌、葡萄糖和乳酸、氨、甲基乙二醛（以胎牛血清来降低其浓度）八、动物细胞工程的实例1、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）生产工艺2、抗HbsAg的单克隆抗体生产工艺（略）

动物细胞大规模培养在制药中的应用作为反应器用于制药：如t-PA、EPO、凝血因子ⅧⅨ、干扰素、生长激素2.作为宿主细胞用于制药：病毒利用培养的细胞复制和具有无限增殖潜力的细胞系推动了疫苗的生产3.制备杂交瘤细胞，生产单克隆抗体：甲肝病毒单克隆抗体、抗人IgM单克隆抗体4、本身作为产品：人造器官、组织工程皮肤、胰岛细胞、脑细胞、肾细胞的移植、羊水穿刺5、药学研究细胞体外测试系统研究药物的药理、毒理和作用机制1、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）生产工艺组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，它可使组织纤溶酶原活化成纤溶酶，而纤溶酶可水解纤维蛋白，因此组织纤溶酶原激活剂对血栓具有治疗作用。培养基---Eagle培养基，加入青霉素100U/ml、链霉素100U/ml、10%小牛血清。

人纤溶酶原（Plasminogen,Plg）经纤溶酶原激活剂（PA）激活，转变为纤溶酶（Plm），不仅能发挥纤溶作用，溶解血栓，而且参与体内一系列与蛋白质水解有关的生理、病理过程，如炎症、组织重建、排卵、肿瘤细胞侵袭与转移，对它的研究可为研制新型溶栓、抗炎、抗肿瘤药物提供新思路**tPA进入血浆后与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，迅速失去活性，肝细胞膜上也有tPA特异性受体，可快速与tPA结合，降低其半衰期，因此治疗剂量很高，同时海马回等脑组织含有丰富tPA受体，所以用于溶栓治疗时，颅腔出血的发生率比其他溶栓药物高纤溶酶的底物专一性很差，水解纤维蛋白原、Ⅴ因子、Ⅷ因子，如果不加控制，将会增加出血的危险，如果有血浆蛋白α2-AP，它就可以中和纤溶酶，还可以缓慢降解凝血块表面的纤溶酶（1）t-PA抗体的制备（2）抗t-PA的亲和吸附剂的制备

[A]、Sepharose4B的活化

[B]、抗t-PA亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备（3）细胞培养（4）t-PA的分离（5）t-PA的精制（1）t-PA抗体的制备取人t-PA、或者猪心t-PA

→按每只家兔200-300ug的计量，t-PA采用福氏完全佐剂充分乳化，注射入家兔皮下。

→每隔2周再用t-PA100ug进行加强免疫，共加强2次

→取家兔血清

→用50%硫酸铵盐析

→沉淀物于0℃下，用生理盐水透析

→经过Sephadex75柱层析

→得到抗t-PA的免疫球蛋白IgG备用（2）抗t-PA的亲和吸附剂的制备[A]、Sepharose4B的活化[B]、抗t-PA的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备

[A]、Sepharose4B的活化Sepharose4B用10倍体积的蒸馏水（V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽滤

→取20克Sepharose4B湿凝胶放入500ml的三颈烧瓶中，加蒸馏水30ml，搅均匀后，用2mol/L的NaOH溶液调节PH=11，降温至18℃

→在通风橱中，另取溴化氰1.5g于乳钵中，加入30-40ml蒸馏水分多次研磨溶解

→将溴化氰溶液倒入三颈烧瓶中，升温至20-22℃，同时滴加2mol/L的NaOH溶液调节PH=11-12

→等反应液PH值不变时，继续反应5分钟，取出烧瓶，向其中投入小冰块降温，用3号垂熔漏斗抽滤[A]、Sepharose4B的活化

→用300ml、4℃、0.1mol/L的NaHCO3溶液洗涤。然后用300ml、PH=10.2、0.025mol/L的硼酸缓冲液分3-4次抽滤洗涤

↓

最后转移至250ml的烧瓶中，加入50-60ml的硼酸缓冲液，即得活化的Sepharose4B，备用[B]、抗t-PA的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备取步骤-2中的抗t-PA的免疫球蛋白IgG，70-80mg溶于20ml硼酸缓冲液中、过滤。滤液加入到已经活化的Sepharose4B中，10℃下搅拌反应16-18小时

→第二天装柱，用10倍柱床体积（V/V）、PH=10.2的硼酸缓冲液，以5-6ml/min的流速洗涤柱床。收集流出液，测定其A280

→用5倍柱床体积（V/V）的、PH=10.0、0.1mol/L乙醇胺溶液洗涤柱床

→用5倍柱床体积（V/V）的、PH=8.0、0.1mol/L硼酸缓冲液洗涤柱床[B]、抗t-PA的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备

→用5倍柱床体积（V/V）的、PH=7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤平衡。

→直到流出液的A280小于0.01，所得到的固定化抗t-PA的免疫球蛋白IgG，就是待提取的t-PA的亲和吸附剂。

→将其转移至含0.01%NaN3的、PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液中，于4℃下贮存，备用（3）细胞培养取5L玻璃转瓶，按每平方米表面积2.5L的比例加入细胞培养液。

→将人黑色素瘤细胞按常规方法消化分散、洗涤、计数、稀释成细胞悬液。

→将细胞悬浮液接种到转瓶之中，接种浓度为103—3*103个/ml

→置于CO2培养箱中，37℃下培养、通入含5%CO2的无菌空气

→等到长成致密单层之后，弃去培养液，

用PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤细胞单层2-3次。（3）细胞培养→换入无血清Eagle培养液继续培养

→每隔3-4天收获一次培养液，用于制备t-PA。

同时向转瓶中加入新鲜无血清Eagle培养液继续培养

→如此反复，可获得大量t-PA。（4）t-PA的分离步骤-4中所收集到的培养液中，加入蛋白酶抑制剂aprotinin至5万单位/ml。加吐温-80至于0.01%、过滤、除去沉淀.滤液稀释3倍

→稀释液上柱，以5ml/min的流速进入t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和柱（直径4cm*长度40cm）。

→用含0.01%的吐温-80+2.5万单位/ml的蛋白酶抑制剂aprotinin+0.25mol/L的KSCN的PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液以同样的流速洗涤亲和柱，以除去杂蛋白（4）t-PA的分离→最后用3mol/L的KSCN溶液洗脱亲和柱，

以每管10-15ml的体积进行分区收集

合并t-PA的洗脱峰，

→装入透析袋内，埋入到PEG20000中浓缩至原体积的1/10-1/5。

→各t-PA粗提物（5）t-PA的精制t-PA粗提物

→进Sephadex-G-150柱（直径2cm*长度100cm）

→用含0.01%的吐温-80的1mol/L的NH4HCO3溶液以2-3ml/min的流速进行洗脱

→以每管10-15ml的体积进行分区收集

合并t-PA的洗脱峰，

→于冻干机中进行冻干

→得t-PA精品抗HbsAg的单克隆抗体生产工艺简要步骤一、培养基1、大鼠骨髓瘤IR983F细胞系的培养基为Dulbecoo`sEagle培养基（DMEM培养基）2、杂交瘤细胞筛选系统的培养基用含HAT的DMEM培养基二、饲养细胞的制备----大鼠腹腔巨噬细胞的培养三、亲本细胞的制备1、大鼠骨髓瘤IR983F细胞亲本的制备2、受HbsAg免疫的大鼠脾淋巴细胞亲本的制四、抗（HbsAg）的单克隆抗体-亲和吸附剂（HbsAg-McAb-Sepharose-4B）的制备抗HbsAg的单克隆抗体生产工艺简要步骤五、细胞融合六、杂交瘤细胞的筛选七、抗（HbsAg）的单克隆抗体（McAb）的动物活体反应器生产八、抗（HbsAg）的单克隆抗体（McAb）的分离和纯化杂交瘤技术的基本过程骨髓瘤细胞免疫小鼠取出脾脏3d单细胞悬浮PEG细胞融合HAT培养基37℃，5%CO2筛选抗体株克隆阳性细胞,1细胞/孔增殖阳性克隆腹水制备中空纤维反应器扩大培养冻存细胞-70℃或液氮第三节、植物细胞工程一、植物细胞培养概况二、植物细胞培养的基本概念三、植物细胞培养的技术流程四、植物细胞工程的应用五、植物细胞培养的实例一、植物细胞培养概况1、可供培养的植物种类（1）到目前为止，有研究显示，近300种植物的细胞培养物能够产生400多种有效的药用成份。（2）许多药用植物如人参、长春花、紫草、甘草、紫杉、银杏、黄连等，其细胞培养十分成功。（3）据初步统计，有约30种化合物在培养细胞中的含量已经超过1%，如紫草素的含量可达12%、小檗碱的含量可达1%，人参皂苷可达7%。一、植物细胞培养概况2、目前现存的问题（1）技术工艺还不够成熟。（2）提高单位培养基中有效物质的产量（3）降低目的产物的生产成本（4）改进培养条件（5）筛选高产细胞株（6）研制适合于植物细胞培养的新型反应器二、植物细胞培养的基本概念1、植物细胞培养的定义----植物组织和细胞培养是指在无菌条件、人工控制的营养和培养基、人工控制的环境条件如光照、温度下，研究植物的细胞、组织、器官，以及控制其生长发育的技术。它是对细胞进行遗传操作及细胞保藏的基础，针对植物的培养主要有植物组织培养、植物细胞培养、花药及花粉培养、离体胚培养以及原生质体培养这几个大类2、植物细胞培养的类别----13大类3、次级代谢产物和植物细胞的培养特性2、植物细胞培养的类别（1-6）（1）植物培养----幼苗和较大植株的培养称为植物培养。（2）愈伤组织培养----从植物体各种器官的外植体通过增殖而形成的愈伤组织，并对其进行培养的方法，称为愈伤组织培养。（3）悬浮培养----能够保持较好分散性的离体细胞、或者是较小的细胞团的液体进行培养的技术称为悬浮培养。在此培养条件下获得的细胞组织化程度较低。（4）器官培养----离体器官如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基、未成熟的花器官各部分、未成熟的果实的培养，称为器官培养。（5）胚胎培养----对于未成熟或者成熟的胚胎进行离体培养的方式，称为胚胎培养。在培养过程中，如果小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式相同，这一过程就称为“胚胎形成”。如果在体细胞或者花药的培养中，培养物是小孢子这样的单倍体细胞，则它所形成的结构就称为“胚状体或不定胚”。（6）细胞培养----是指利用单个细胞进行液体或者固体培养，并诱导其增殖、分化，其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。2、植物细胞培养的类别（7-13）（7）分生组织培养----又称生长锥培养，是指在人工培养基中培养茎端分生组织。茎端分生组织仅仅位于茎尖顶端的园锥区，其长度小于0.1mm。（8）外植体培养---外植体是指植物组织器官的切段，如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉进行培养称为外植体培养。（9）器官形成---是指在组织培养和悬浮培养基中，植物芽、根、花等器官的形成一分化。首先形成小根基，然后在其基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽、最后形成小植株的过程。（10）无性繁殖系---又叫克隆，是指通过对培养物进行反复的继代培养，利用同种外植体来获得越来越多的无性繁殖系。如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系。（11）突变体---细胞本身由于变异、或者是通过应用诱变技术进行处理，所获得的遗传变异性新细胞，称为突变体。（12）原代培养和继代培养---由外植体上切下来的组织细胞的第一代培养称为“原代培养”、从此以后的多代培养则称为“继代培养”（13）连续培养---是指在培养罐中不断地加入新的培养基、并且连续收集培养物，以保持反应平衡而进行的长期不转移的培养方式。3、次级代谢产物和植物细胞的培养特性1、植物体内次级代谢产物具有以下特征：（1）有明显的分类学区域界限，（2）其合成需要在一定条件下才能进行，（3）缺乏明显的生理功能，（4）是生命过程的多余成份。如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素。2、植物细胞的培养特性：（1）植物细胞较微生物细胞大得多，具有纤维素细胞壁。（2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染、需要用抗生素。（3）在细胞生长的中期和对数期，容易凝聚成直径达350-400um的团块，悬浮培养比较困难。（4）培养时需要供氧，培养液粘度较大，不能耐受强力通风搅拌。（5）细胞具有群体效应、无锚地依赖性和接触抑制性。（6）细胞培养产物多数滞留于细胞内，产量较低。（7）培养过程中保持结构、功能上的全能性。三、植物细胞培养的技术流程（一）植物材料的准备和处理（二）培养基（三）培养方法（四）植物细胞种质保存技术（五）植物细胞突变体筛选技术（六）植物原生质体培养技术（七）植物细胞融合技术（八）影响植物次级代谢产物积累的诸因素分析（一）植物材料的准备和处理用于植物组织培养的外植体，必须是无菌材料。在培养之前必须对外植体进行严格的灭菌处理。植物不同的组织，所需要的灭菌步骤也各不相同

1、常用的灭菌试剂2、灭菌步骤1、常用的灭菌试剂次氯酸钙 9-10% 5-30分钟

次氯酸钠 0.5-5% 5-30分钟

过氧化氢 3-12% 5-15分钟

溴水 1-2% 2-10分钟

硝酸银 1% 5-30分钟

氯化汞 0.1-1% 2-10分钟

抗生素 4-50mg/L 30-60分钟

最常用的是----次氯酸钠、次氯酸钙、氯化汞。（1）种子灭菌前处理----纯酒精中浸泡10分钟，再用无菌水漂洗。灭菌----100g/L次氯酸钙浸泡20-30min，再用10g/L溴水浸泡5min。灭菌后处理----无菌水洗3次，然后在无菌水中发芽。（2）果实和茎切段灭菌前处理----纯酒精漂洗灭菌----20g/L次氯酸钠浸泡10min灭菌后处理----无菌水反复冲洗3次，然后再剖开内部种子。2.灭菌步骤

2.灭菌步骤

（3）储藏器官和叶片灭菌前处理----自来水洗净灭菌----20g/L次氯酸钠浸泡20-30min灭菌后处理----无菌水反复冲洗3次、滤纸吸干。（二）培养基1、植物细胞的营养需求2、培养基的组成成份3、培养基的配制原则和常见的培养基类型1、植物细胞的营养需求（1）无机营养物---N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo（2）维生素---维生素B1、B6，烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙、叶酸。（3）碳源---蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、山梨醇。（4）天然物---水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取物、香蕉汁、荸荠汁、苹果汁。（5）氨基酸类---甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、天冬酰氨、酪氨酸、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、胸腺嘧啶。（6）核酸及其水解物---DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶。（7）植物激素：生长素类---吲哚-3-乙酸（LLA）、赤霉素（GA3）细胞分裂素类---6-苄氨基嘌呤（6-BA）、脱落酸（ABA）、乙烯萘乙酸（NAA）、2、4-D、吲哚乙酸。其它激素类---长蠕孢醇、核盘菌素、油菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米素、向日葵素、精子囊素。（8）其它成份---氯化胆碱、胆质素、苹果酸、反丁烯二酸、固形剂、琼脂。2、培养基的组成成份AlCl3 CaCl2*2H2O Ca（NO3）2*4H2OCoCl3*6H2O CuSO4*5H2O FeCl3*6H2O Fe2（SO4）3 FeSO4*7H2O H3BO3 KCl KH2PO4 KI KNO3MgSO4*7H20 MnSO4*H2O MnSO4*4H2O NaH2PO4 NaH2PO4*H2ONaH2PO4*2H2O NaNO3 Na2EDTA Na2EDTA*2H2O Na2MoO4*2H2O Na2SO4 NH4NO3 （NH4）2SO4NiCl2*6H2O ZnSO4*7H20 肌醇烟碱酸 泛酸 盐酸吡咯醇核黄素 盐酸硫胺素 3、培养基的配制原则和常见的培养基类型（1）培养基的配制原则母液配制时各成份浓度应该比实际使用浓度扩大一定倍数，使用时稀释。培养液应该维持PH值恒定，常用1mol/L的HCl、或者1mol/L的NaOH进行调节。培养基分装之后，外加棉花塞和牛皮纸包扎，在82.74--1030.42kPa压力下、121℃下、消毒灭菌20min、冷却之后就可以用于接种。3、培养基的配制原则和常见的培养基类型（2）常见的培养基类型Gamborg`sb5培养基 Heller`ssalts培养基Linsmaier-Bednar&Skoog培养基 Murashige&Skoog培养基（MS）Nitsh`sH培养基 Schenk-Hildebrandt培养基Takebe培养基 White`s-3salts培养基（三）培养方法1、固体培养体系2、液体培养体系3、大规模工业化生产方法1、固体培养体系（1）定义---固体培养体系包括利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养技术。是指在培养基中加入一定量的凝固剂，经过加热溶解—装瓶—冷却—凝固之后形成固体培养基。（2）常用的固化剂琼脂 藻酸盐 角叉藻聚糖 明胶 羟乙基纤维素 聚丙烯酰胺淀粉 硅胶（3）优点---简便易行、所占空间较小。（4）缺点：外植体或愈伤组织只有一部分与培养基发生接触，接触部位的营养物质可被迅速吸收，从而形成培养基中营养物质的浓度差，结果导致愈伤组织的生长不平衡。由于外植体的基部插入到固体培养基中，使得此外呈现出气体交换不畅的状态，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，同时也会大量堆积生长过程中积累的有害物质。由于重力作用，以及光线从上部或者一侧射入，常常导致愈伤组织细胞间出现极化现象，结果导致细胞细胞群体的不均匀。当固体培养出的植株转入液体环境时，常常导致组织很快膨胀。2、液体培养体系（1）悬浮培养法（2）平板培养法（3）微室培养法（4）看护培养法（1）悬浮培养法定义----游离的植物细胞悬浮于液体培养基中进行培养的方法称为悬浮培养法。基本步骤----将愈伤组织、无菌苗、吸涨的胚胎、外植体尖芽、根尖、叶肉组织，经匀浆器械掏碎，纱布或者不锈钢网过滤，提到的单细胞滤液作为接种材料，接种于试管或者培养皿中进行振荡培养。特点----其培养过程能够严格地出现重复的周期性变化，所培养的细胞具有典型的指数增长规律，分别有延迟期、对数生长期、减慢生长期、静止期。需要进行不断的继代培养。（2）平板培养法定义----分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基器皿内进行培养的过程称为平板培养方法。基本步骤----将消化分散后的细胞在除去消化液之后，经过浓缩和计数，再接种到35℃左右的固体培养基之中，于25℃、含5%CO2的培养箱之中进行培养，细胞即可生长成团。（3）微室培养法定义----悬浮的单细胞接种于由玻璃环和盖玻片所构成的微室之中的固体培养基中，进行培养的方法。基本步骤----在微室内预置琼脂培养基，然后接种细胞悬浮液，再盖上盖玻片，然后在盖玻片的外沿用石蜡或者凡士林进行密封，置于CO2培养箱中培养，维持温度26-28℃，细胞即可生长。优点----能够直接观察细胞分裂和组织分化的全过程，同时可以进行显微镜摄像。（4）看护培养法基本步骤----在三角烧瓶中加入固体培养基，在培养基上放置一块直径为几毫米的愈伤组织，再地组织块上放置一张经过灭菌的滤纸，次日在滤纸上就会吸收由组织块中渗出的培养基成份，最后将细胞接种于滤纸上面，置于CO2培养箱中培养，维持温度26-28℃，细胞即可生长。优点----操作简便，能够为单细胞生长提供良好的环境。缺点----培养时间较长，不能直接进行观察3、大规模工业化生产方法（1）成批培养法（2）半连续培养法（3）连续培养法（4）固定化培养法（1）成批培养法定义----将培养基一次性地加入到反应器之中、接种、培养一定时间之后，收获细胞的操作方法。实例----1953年Tulecke设计了一个20L的培养瓶，并利用这个系统培养了银杏、冬青、黑麦草、蔷薇等植物细胞。日本人发明了二步培养法，第一步用于细胞数量的增殖，第二步则用于次级代谢产物的生产，成功生产出第一个植物细胞工程产品----紫草素。（2）半连续培养法[A]、定义----