硝基苯类化合物微生物降解研究进展

硝基苯类化合物微生物降解研究进展

1硝基苯类污染环境修复方法硝基苯磺酸具有广泛的应用于农药、染料、爆炸、橡胶、其他原料的生产。环境中的硝基苯磺酸主要包括硝基苯、硝氯苯、硝基苯酚、硝基苯胺和硝基苯甲酸。硝基苯磺酸具有广泛的用途。它可以通过废水进入环境，也可以由于运输和生产过程中的意外事故和储存罐的不当处理而进入环境。大多数硝基苯磺酸具有稳定性、高毒性和易生物积累的特点。已被列入美国国家环境管理局（epa）和中国环境监督管理总局的污染物名单。硝基苯类污染环境的修复方法主要包括物理法、化学法和生物法.物理法主要是利用多孔树脂和活性炭等吸附污染物;化学法主要是利用氧化反应来消除污染物;生物法主要是利用人工驯化或构建的工程菌来降解污染物,最终使污染物矿化.与化学法和物理法相比,生物处理法的优点是费用低,不易造成二次污染,可最大程度地降低污染物的浓度,应用范围广.同时,含有硝基苯类化合物的废水往往是多种污染物共存,利用微生物之间的协同作用和微生物对底物的共代谢效应,能够同时去除多种污染物,加快硝基化合物的降解.因此,随着生物强化技术和基因工程技术的广泛应用和发展,在防治硝基苯类化合物的环境污染方面,生物处理法具有广阔的应用前景.在过去的几十年里,环境科技工作者不仅在宏观上研究了微生物生态系统对污染环境的修复,而且在微观上对降解菌的分离和纯化、降解质粒的分离和基因工程菌的构建进行了研究.本文从降解菌的驯化筛选、降解途径、降解机理、共代谢、趋化性和分子遗传学角度,阐述了硝基苯类化合物生物降解的最新研究进展.2硝基苯类化合物的降解硝基的亲电子性、苯环结构的对称性使得硝基苯类化合物不易被微生物降解,并且随着苯环上取代硝基的增多,生物降解性逐渐降低.国内外学者在菌种的驯化和筛选方面进行了大量的研究.降解菌主要来自受污染的土壤、地下水、地表水、活性污泥及河道底泥等;在驯化过程中使用单一菌源或混合菌源.驯化培养基是以硝基苯类化合物为唯一碳源、氮源、能源,或以硝基苯类污染物为唯一氮源而琥珀酸盐或其它易降解底物为唯一碳源和能源的液体培养基,其目标物加入浓度≥0.5mmol·L-1.利用单一或混合目标物,在30℃~35℃、转速为150~200r·min-1、pH为7.0~7.5条件下好氧振荡培养或厌氧培养.Haigler等利用硝基苯污染的土壤和底泥,驯化培养出1株能以2-硝基甲苯为唯一碳源和氮源的Pseudomonassp.JS42菌株.Lenke等利用2,4-二硝基苯酚为唯一氮源、琥珀酸盐为唯一碳源和能源的培养基,驯化培养出RhodococcuserythropolisHL24-1和HL24-2两种菌株.实验结果表明,这两种菌株均能以2,4-二硝基苯酚作为唯一的氮源和碳源.由于硝基苯类化合物不易彻底降解,所以可以分别驯化和筛选降解目标污染物和中间代谢产物的降解菌,再利用混合菌彻底降解硝基苯类化合物.由于硝基苯类化合物的降解酶大多数为诱导酶,并且很多结构相似的化合物其初始降解途径相同,因此,可以利用较易被微生物降解的低毒性化合物,驯化培养出高毒性且难降解的同类化合物的降解菌.例如,以硝基苯为唯一碳源和氮源驯化培养出的菌株,能够降解3-氯硝基苯和4-氯硝基苯.部分国内外学者筛选和驯化的硝基苯类化合物降解菌和初始降解酶见表1.3带的路径和机制3.1氧化反应的代谢路径3.1.1pseudom根硝基苯类化合物在加氧酶的作用下脱掉苯环上的硝基,形成相应的酚,进一步由双加氧酶作用,开环降解形成烯酸类物质,而脱除的硝基形成亚硝基盐,可被微生物利用为氮源.例如,2,4-二硝基甲苯首先被氧化成4-甲基-5-硝基儿茶酚,最后降解为2-羟基-6-氧-2,4-二烯酸.PseudomonasputidaFl和Pseudomonassp.JS150首先将4-硝基甲苯氧化成3-甲基-6-硝基儿茶酚.Pseudomonassp.JS51降解间硝基苯甲酸时,先是在3,4-双加氧酶的作用下形成3,4-二羟基苯甲酸,然后在4,5-双加氧酶的作用下,开环降解.2,6-二硝基甲苯被双加氧酶氧化成3-甲基-4-硝基儿茶酚.对硝基酚在1,2-双加氧酶作用下形成4-硝基儿茶酚,接着脱硝基形成1,2,4-苯三醇,最终降解.对硝基苯酚和2,2-联吡啶共存时,Moraxellasp.菌株可通过单加氧酶将对硝基苯酚脱硝基氧化成对苯二酚.3.1.2双加氧酶法pseudom根治化硝基苯类化合物可以在加氧酶的作用下进行不脱硝基的初始降解.例如,甲苯降解菌PseudomonasputidaF1和Pseudomonassp.JS150在以2-硝基甲苯和3-硝基甲苯为唯一碳源生长时,初始降解产物分别为2-硝基苄醇和3-硝基苄醇,然后再将其降解为硝基苯甲酸.4-硝基甲苯在Pseudomonassp.4NT的作用下,首先被氧化成对硝基苯甲酸,接着进行硝基还原和脱氨作用,最后生成烯二酸类物质.双加氧酶可直接作用于苯环,形成硝基邻苯二酚,再进一步开环降解.Haigler等报道,先用含甲苯的培养基培养恶臭假单胞菌菌株,诱导产生甲苯2,3-双加氧酶,再用硝基苯培养,硝基苯被转化成3-或4-硝基邻苯二酚,而后进一步开环降解.3.2n-fmo-4-羟基芳香化合物及乙酰胺的合成硝基苯类化合物的还原代谢主要是硝基被还原为亚硝基、羟氨基,再根据具体的环境选择降解途径,主要有以下几种:1)在羟氨基裂解酶的作用下脱氨基,形成二羟基芳香化合物.ComamoaasacidovoransNBA-10菌株降解4-硝基苯甲酸时,首先生成4-羟氨苯甲酸盐,接着生成3,4-二羟基苯甲酸盐.2)硝基还原生成芳香胺.在有氧条件下,脱氨基生成相应的二羟基芳香化合物,开环或直接氧化开环,再脱氨基.3)羟氨基还原成氨基后经乙酰化作用生成乙酰胺.Rhodosporidiumsp.菌株可通过硝基还原途径转化对氯硝基苯,终产物为4-氯-乙酰苯胺和4-氯-2-羟基-乙酰苯胺.4共代谢与多株昆虫共生体的分解4.1其它微生物的协同作用Leadbetter和Foster在1959年发现甲烷产生菌P.methanica在甲烷存在的情况下能够将乙烷氧化成乙醇、乙醛和乙酸,但是乙烷及其任何一种代谢产物对甲烷细菌的生长没有任何作用,将这种现象称为共氧化.后来Jesen将其进行了拓展,提出了微生物共代谢作用的概念.一些难降解的有机化合物不能直接作为碳源或能源物质被微生物利用,而当环境中存在其它可利用的碳源或能源时,难降解有机化合物才能被利用,这样的代谢过程称为共代谢作用.例如,20世纪60年代发现,一株假单胞菌不能单独利用三氯乙酸作为碳源生长,但在一氯乙酸存在时可以使三氯乙酸脱氯.微生物共代谢作用的发生有以下几种情况:1)依靠降解其它有机物提供能源,例如,直肠棱菌需要有蛋白胨类物质,才能降解丙体六六六;2)依靠其它微生物的协同作用,例如,农药二嗪农的嘧啶基环的降解需要链霉菌和节杆菌共同协作,而两菌各自单独存在则不起作用;3)先经别的物质诱导,例如,一株铜绿假单胞菌经正庚烷诱导才产生相应的羟化酶系.微生物共代谢作用的机理虽然目前尚存在争论,但通常的解释是:微生物在生长基质的诱导下,产生专一性不强、底物范围较宽的诱导降解酶,在与生长基质共存时,这种诱导酶可实现对非生长基质的部分降解;在生长基质被完全消耗时,休眠细胞通过内源代谢可以维持诱导酶的活性,继续对非生长基质进行转化.由于微生物共代谢作用,能够产生一些新的代谢途径,而且对多种有机污染物共存体系具有较高的降解能力.共代谢在难降解的有毒有机污染物的去除和污水处理领域具有重要作用.从基质的角度可以将共代谢研究分为两个方面:1)以易被微生物降解的无毒有机物作为共代谢的生长基质,例如,Acinetobactersp.ODDK71菌株在以十六烷作为生长基质时,以共代谢的方式对烷基环己烷进行降解.Horvath等研究表明,氟苯甲酸盐不能被土壤混合微生物作为生长基质利用,但和葡萄糖共存时可被完全降解.硝基苯和琥珀酸盐共存时容易被微生物降解.吉氏拟杆菌和屎拟杆菌等菌株能够与葡萄糖共代谢,还原硝基苯,1g葡萄糖共代谢还原200~260mg硝基苯.环糊精可以提高降解菌对硝基苯的耐受浓度,缩短降解菌的停滞时间,促进降解菌的生长,加快硝基苯的降解.3-氯硝基苯和4-氯硝基苯在和琥珀酸盐共存时,可被Pseudomonasputida部分降解.2)对于化学结构相似的有机物共存体系,通过较易降解的有机物来诱导关键的降解酶系,从而降解较难降解的有机物.例如,硝基苯诱导降解菌可以降解硝基氯苯;甲苯降解菌可以降解硝基甲苯.由于污染环境中有机物成分的复杂性和工业废水组成的多样性,在实际工作中微生物共代谢还应用于不同有机污染物共存时相互作用的研究方面.例如,2,6-二硝基甲苯抑制2,4-二硝基甲苯降解菌的降解活性.苯胺对硝基苯的还原反应为协同作用.虽然假单胞菌能够以苯酚作为唯一的碳源,但是苯能够抑制苯酚水解酶的产生,所以假单胞菌无法代谢苯酚与苯的混合物.4.2菌种体系对微生物降解的影响在自然条件下,有机物的降解往往是在由多菌属微生物组成的群落水平上进行的,即相关的微生物群体单独存在时不能代谢,只有生活在一起时才能完成.微生物之间的这种协作关系在难降解有机污染物的生物降解菌人工合成方面具有重要作用.例如,对硝基苯类污染物而言,由于单个菌种往往不具备一整套完整的降解酶系或基因成分,在用单一微生物进行的纯培养中,往往难以实现污染物的矿化.自然环境中多种微生物并存,单一培养的微生物在实际应用中还面临生存竞争问题.因此,开展多菌株复合体的微生物降解研究具有重要的理论与实践意义.一方面,多菌株体系能够利用优势菌株来适应变化的环境,这一特点可以保证易变环境中污染物的降解效果;另一方面,可以通过不同菌株的协同作用实现难降解有机物的部分或彻底降解.目前,利用混合菌进行的降解研究主要包括:1)以共存污染物的单一组分为唯一基质,驯化各自的降解菌,再将降解菌混合;2)以降解菌为主,外加功能细菌,例如,修复有机污染河流时可以加入光合细菌和硝化细菌;3)先驯化和分离出目标污染物的降解菌,再驯化和筛选以其中间代谢产物或终产物为基质的降解菌,再将菌株混合.例如,可单独降解硝基苯的枯草芽苞杆菌和人苍白杆菌在降解硝基苯时存在协同作用.Park等把能将3-氯硝基苯和4-氯硝基苯分别还原成5-氯-2-羟基乙酰苯胺和4-氯-2-羟基乙酰苯胺的PseudomonasputidaHS12菌株和能降解5-氯-2-羟基乙酰苯胺和4-氯-2-羟基乙酰苯胺的菌株Rhodococcussp.HS51共同培养,在其它碳源存在的情况下,实现了3-氯硝基苯和4-氯硝基苯的矿化.例如,诺卡氏菌和假单胞菌生活在一起时,能降解环己烷,而各自单独存在时,便无此能力.另外,具有协作关系的某两个群体能共同产生一种酶,代谢某种底物,而单独生活时,就不能合成这种酶.Pseudomonasstutzeri仅能把马拉硫磷裂解成对硝基苯酚和二乙基硫磷酸,而不能进一步代谢这两种中间产物,而Pseudomonasaeruginosa能矿化对硝基苯酚,但不能分解马拉硫磷.当这两种菌生活在一起时,便可以很有效地降解马拉硫磷.5微生物的正向趋化反应细菌的趋化性是指运动细菌趋向某些化学吸引剂(正向趋化反应)或避开某些化学驱斥剂(负向趋化反应)的移动行为,这种现象是Engelmann于1883年发现的.有机污染物微生物降解的首要前提是降解细菌与其降解底物的直接接触,而远离底物的细菌可以借助趋化反应主动向底物靠近,因此微生物的正向趋化反应在污染物的生物降解方面具有重要作用.Pseudomonassp.ZWL73菌株对4-CNB等12种化合物均表现出趋化性,而这些化合物大多能被用作ZWL73的生长底物,且趋化性是由降解质粒所控制.Parales研究发现,3种假单孢菌菌株对硝基苯甲酸盐和氨基苯甲酸盐产生趋化性.Sanmata等的研究表明,Ralstoniasp.SJ98只对能降解的硝基芳香族化合物NACs(nitro-aromaticcompounds)有趋化性,而对不能降解的NACs则无趋化性.目前,硝基苯类化合物的趋化性研究相对较少,主要是研究趋化性和降解性以及质粒之间的关系,今后应该进一步研究如何提高微生物的正向趋化能力,以便增强低浓度有机污染物污染环境的修复效果和加快修复速度.6微生物防治废水随着有毒化合物大量进入各种生态环境中,许多土著微生物能够在原有的遗传基础上很快进化,降解很多过去被认为是难以生物降解的物质,而编码这些代谢活性的遗传信息常常位于质粒或染色体上.质粒和染色体可以分别编码某一化合物不同降解途径的酶,互相补充,也可以单独编码.降解质粒上的降解基因只能通过接合方式实现种内或种间转移.结合转移可使不具备降解能力的菌株获得降解能力,也可以组建多质粒的新菌株和实现降解性质粒DNA和染色体DNA的体外重组,构建降解效率高、底物范围广、表达稳定、比自然环境中的微生物更具竞争力的工程菌,从而开辟有机物降解的新途径,实现难降解有机物的矿化.这一研究领域是生物技术应用于环境保护的研究热点之一.PseudomonasC1S1菌株能通过氧化途径脱除2,4,6-三硝基甲苯上的3个硝基,并将其作为生长的唯一氮源,但不能将甲苯作为唯一的碳源.将降解甲苯的Pseudomona的TOL质粒转移至C1S1菌株中后,获得了能同时脱除硝基和降解甲苯的转移结合子,而获得结合子的C1S1菌株能利用TNT为唯一的碳源、氮源和能源,并使硝基和甲苯彻底降解.Suen等在研究假单胞菌DNT菌株降解二硝基甲苯的氧化代谢途径的基础上,对其中3种加氧酶(二硝基甲苯双加氧酶、4-甲基-5-硝基邻苯二酚单加氧酶和2,4,5-三羟基甲苯加氧酶)的基因进行了克隆,并分析了这些基因的遗传结构,发现分别在3个不同的操纵子上,利用含有这些基因的DNA片段,可检测相似代谢途径中的同源基因.Wu等鉴定了4-氯硝基苯和硝基苯降解菌株Comamonassp.CNB1降解质粒pCNB1的两个基因片断cnbB-orf2-cnbA和cnbR-orf1-cnbCaCbDEFGHI,并克隆和表达了7个基因.结果表明,CnbA编码硝基还原酶,CnbB编码1-羟氨基苯变位酶,CnbCab编码2-氨基酚1,6-双加氧酶,CnbH编码2-氨基-5-氯已二烯二酸脱氨酶.其中,CnbH编码的脱氨酶可使4-氯硝基苯和硝基苯产生新的还原途径.Hughes等克隆、测序和鉴定了PseudomonasputidastTW3DNA的6-kbp片断,发现6-kbp包含5个基因,其中两个编码将4-硝基苯甲酸降解