1株荚膜血清a型巴氏杆菌的分离鉴定

1株荚膜血清a型巴氏杆菌的分离鉴定

巴氏杆菌是一种条件性疾病。这种疾病通常生长在总理和猴子的粘膜和扁桃体上。由于其他致病性因素的相互作用，身体的吸引力降低，细菌在兔子体内广泛繁殖，导致兔子病情恶化（郭慧霞等，2010；刘继山等，2013）。长毛兔饲养周期较长,鼻炎、肺炎、中耳炎的发生率居高不下,一直是影响长毛兔健康状况,也是决定其淘汰率的一大因素。山东某大型长毛兔养殖场成年家兔发生了一种以肺脏出血、化脓、坏死等为症状的疾病,该病能导致家兔消瘦、零星死亡,占总死亡率的60%以上,特别是进入夏季以来其淘汰率进一步上升,一度达月死亡率的5%以上,年淘汰率达到60%。病死长毛免的临床症状:病兔消瘦、骨瘦如柴,毛色不光滑、没有光泽、密度小,呼吸急促、腹式呼吸,鼻部潮湿、有脓性分泌物,食欲基本正常,粪便基本正常,未表现明显的其他临床症状(刘吉山等,2013)。其剖检变化:主要集中于呼吸道和肺脏,鼻窦内有白色奶油状分泌物,有的呈干酪样物质,气管内黏液增多,气管出血,胸腔内积满脓汁,心包黏连,胸腔黏连,单侧肺脏或双侧肺脏几乎消失,充满白色脓汁或奶油色干酪样物质(图1、2)。鉴于病死兔的临床症状及病理变化,作者在实验室对其进行了病原分离、生化试验、16SrRNA鉴定、药敏试验、动物试验及本场疫苗的制备与免疫试验。为对该病进行有效防控,本试验设计了3组防控措施,经征得场主同意,在该兔场进行了一系列临床试验,通过对比试验筛选出了一组最为有效的防治措施,并对该场进行了全场防控,取得了较好效果。1材料和方法1.1材料表面1.1.1疾病信息来源1.1.2基材料药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司;微量糖发酵管购自上海市医学化验所试剂厂;麦康凯培养基购自青岛海博生物工程有限公司;马丁肉汤购自山东雨林生物制品有限公司,按说明书配制,灭菌后加入1%裂解血和4%鸡血清;马丁血清裂解血平板在以上基础上加入2%琼脂粉,灭菌,倾倒平板即可(陈天寿,1994)。明胶、MR等生化培养基按常规方法配制(程安春,1997)。1.1.3试验动物8只体重2.5kg日本大耳白兔、9只18~22g昆明Ⅱ系小白鼠均由山东绿都生物科技有限公司动物试验中心提供。1.2方法1.2.1细菌的分离、培养和纯度陆成平，20011.2.1.血清裂解血平板的制备无菌取病料中的肺脏小脓肿脓液,无菌条件下用接种环划线接种于马丁血清裂解血平板上,37℃培养24h。同时将脓液和培养物涂片后进行美兰及革兰氏染色,油镜镜检,记录结果。1.2.1.2.细菌分离和纯度挑取平板上单个典型菌落接种于马丁血清裂解血平板上,37℃培养24h。将纯化细菌接种于麦康凯培养基,37℃培养48h,观察结果。1.2.2抑菌圈的测定药敏试验采用纸片扩散法进行。从37℃孵育18h的马丁血清裂解血平板上分别取菌苔于灭菌生理盐水中,并将其悬液浊度用生理盐水调至0.5浊度麦氏,直接用此盐水悬液作为接种物。无菌棉签蘸取上述悬液,均匀涂布于9cm马丁血清裂解血平板。待稍干后,用无菌镊子取替米考星(T)、氟苯尼考(F)、恩诺沙星(ENO)、庆大霉素(GM)、头孢噻呋钠(CF)、阿莫西林(AMX)、环丙沙星(CIP)、磷霉素(FOS)、氧氟沙星(OFL)、硫酸新霉素(N)10种常用药敏纸片(纸片直径6.3~6.4mm)平贴在培养基表面,4℃放置2h使药物扩散,然后37℃培养20~24h后观察测量抑菌圈的大小并记录结果。判定标准为:抑菌圈直径<10mm为耐药;直径在14~16mm之间为中度敏感,直径>16mm为敏感。1.2.3糖、葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、糖、鼠李糖、糖、糖、玉米糖、m、明胶将分离菌纯培养物接种于微量糖发酵管(包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、鼠李糖、甘露醇、甘露糖、MR、明胶等),37℃培养72h后记录生化试验结果(徐刚等,2012)。1.2.4引物的合成按照荚膜血清A型巴氏杆菌特异性序列设计1对扩增16SrRNA的引物。引物序列为:s1-a:5′-TGCCAAAATCGCAGT-CAG-3′;s2-a:5′-TTGCCATCATTGTCAGTG-3′,预期扩增片段大小为1040bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。退火温度为55℃,反应体系和反应程序按常规进行,对分离菌进行分子生物学鉴定(奎玲等,2011)。1.2.5动物疾病试验1.2.5.人工感染途径检测取9只健康昆明Ⅱ系小白鼠,5只试验组昆明Ⅱ系小白鼠腹腔接种上述悬浊液0.1mL/只(约108CFU),4只对照组昆明Ⅱ系小白鼠腹腔注射同等剂量的生理盐水,连续观察7d,观察并记录发病和死亡情况(奎玲等,2011)。1.2.5.日本大耳白兔发病条件观察取分离菌培养物接种4只日本大耳白兔,静脉注射1.0mL(约109CFU),连续观察14d,同时设4只对照,分别注射1.0mL生理盐水。日本大耳白兔发病的临床标准为鼻部潮湿、有鼻炎、流脓性鼻液。观察并记录发病和死亡情况并逐只剖检观察病变。1.2.6疫苗准备1.2.6.解血工艺、培养、冷藏将纯化、鉴定后的分离菌接种含4%鸡血清、1%裂解血的马丁肉汤,高密度通气发酵培养,37℃培养12h,培养物加入1‰福尔马林溶液,37℃灭活24h,无菌检验合格后,于4℃冷藏备用。1.2.6.2.制备疫苗1.2.7试验2:长毛兔逐步血清试验应用1.2.6制备的巴氏杆菌本场疫苗进行免疫。在养殖场试验区,挑出明显消瘦及有明显呼吸道症状和严重鼻炎的病兔,不参与试验;有轻微鼻炎症状的长毛兔参与试验,选取2300只,笼位相邻的24月龄长毛兔进行试验。共设试验A、B、C3组,分别为巴氏杆菌本场疫苗免疫试验组、恩诺沙星防治试验组、巴氏杆菌本场疫苗免疫与恩诺沙星联用试验组,另设1个对照组。试验A、C组提前免疫,与试验B组及对照组同时观察至30d。死亡长毛兔逐只剖检,观察其肺脏病变。检查肺脏是否有大面积出血、坏死、化脓,症状符合其一,确定为肺炎死亡指征。试验A组:取600只成年长毛兔,颈部皮下注射1.0mL/(只·次),连续免疫2次,每次相隔1周,随机选择其中500只,自第2次免疫后第4天开始观察,每隔2d记录1次死亡只数,连续观察30d,记录结果。试验B组:取恩诺沙星,按24mg/只(一般3.5~4kg/只),随机选择500只成年长毛兔投喂,每天1次,连用4d,从第1天开始观察结果,每2d记录1次死亡情况,连续记录30d。试验C组:取600只成年长毛兔,颈部皮下注射1.0mL/(只·次),连续免疫2次,间隔1周,且在第2次免疫后第4天投喂恩诺沙星,按24mg/只(一般3.5~4kg/只),每天1次,连用4d。同时,自投药后第1天随机选择其中500只长毛兔开始观察,每隔2d记录1次死亡只数,连续观察30d,记录结果。对照组:取相邻区域500只成年长毛兔作为对照组,不采取任何处理措施,正常饲喂,记录观察结果。2结果与分析2.1革兰氏阴性球杆菌的分离和鉴定在马丁血清裂解血平板上37℃培养24h后,形成圆形、凸起、光滑透明、边缘整齐、湿润的露珠样菌落,直径为1~2mm。脓液和培养物镜检均发现,该分离菌为革兰氏阴性球杆菌,单个或成对存在;美兰染色为两极着色的小杆菌,脓液中细菌和培养物的细菌形态一致。接种麦康凯培养基,37℃培养48h,不生长。分离菌命名为sd-1株。2.2药物敏感试验药敏试验结果显示,分离菌sd-1对替米考星(T)、恩诺沙星(ENO)、氟苯尼考(F)、庆大霉素(GM)、头孢噻呋钠(CF)、阿莫西林(AMX)、环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、磷霉素(FOS)敏感;对硫酸新霉素(N)中度敏感。其中,替米考星、恩诺沙星、氟苯尼考最为敏感,所产生的抑菌圈最大,达30mm以上。2.3德维护斯的分离2.3.1糖酸糖产酸液sd-1株的生化试验结果见表1。由表1得知,sd-1株发酵葡萄糖、果糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖产酸不产气;不发酵乳糖、麦芽糖、鼠李糖;不液化明胶,MR试验阴性,吲哚试验阳性,触酶试验阳性,硝酸盐还原阳性,在麦康凯培养基上不生长,符合巴氏杆菌的生化特征,推测sd-1株为巴氏杆菌。2.3.2大小片段的估计sd-1株PCR检测结果见图3。由图3可知,能得到大小为1040bp的片段,与预期结果相符。结合分离培养、镜检结果及生化试验结果,可证实sd-1株为荚膜血清A型巴氏杆菌。2.4动物疾病试验2.4.1攻毒临床性状观察昆明Ⅱ系小白鼠致病性试验结果见表2。由表2可知,观察7d,sd-1株攻毒昆明Ⅱ系小白鼠5只,全部死亡,对照组4只全部健活,表明sd-1株有较强的致病性。2.4.2对日本大耳白兔的安全性由表3可知,sd-1株攻毒4只日本大耳白兔,2只死亡,2只发病,发病率100%,对照组4只全部健活。表明sd-1株对日本大耳白兔有一定的致病性,在短时间内,部分不死亡,但临床症状明显。剖检死亡兔发现,第4天死亡的兔子肺脏仅见大面积出血及少量化脓灶,第8天死亡的兔子,肺脏出现了化脓性肺炎。将2只存活发病兔剖检发现一侧肺化脓、坏死,充满米粒大小的化脓灶,内有奶油色脓汁,另一侧肺脏少量出血。从发病及死亡兔肺脏均分离到攻毒细菌。2.5死亡率和药物状态长毛兔综合防控试验结果见表4。由表4可知,用药30d后试验A、B、C组以肺炎为死亡指征的死亡率分别为1.6%、2.4%、1.0%,均低于对照组(4.4%)。试验C组的鼻炎明显少,但试验B组30d后鼻炎有明显的增加,且死亡率也有明显的回升;而试验C组前期死亡率较低,鼻炎回升也很慢,症状轻微;试验A组前期死亡率高,后期鼻炎发生率不高,症状很轻微。3讨论3.1巴氏杆菌对日本大耳白兔致病性的影响sd-1株分离菌革兰氏染色镜检为革兰氏阴性球杆菌,单个或成对存在;美兰染色为两极着色。麦康凯培养基上,37℃培养24h,不生长。生化试验结果显示符合巴氏杆菌特点。分子生物学检测显示为荚膜血清A型巴氏杆菌。动物试验结果表明,该菌有足够的致病力引起日本大耳白兔发生化脓性肺炎而引发死亡。由此,确定此次发病由荚膜血清A型巴氏杆菌引起。巴氏杆菌可引起日本大耳白兔的鼻炎、肺炎、败血症、结膜炎、中耳炎、子宫睾丸炎等(王振华,2012),其多样性在临床上常令兽医陷入误诊。此次巴氏杆菌病并未引起日本大耳白兔的急性死亡(败血症),而是引起化脓性肺炎及鼻炎症状,与高光明等(2010)、郭慧霞等(2010)、徐刚等(2012)报道的有所不同,据笔者观察在日本大耳白兔所发生的巴氏杆菌病中以鼻炎、化脓性肺炎、结膜炎、中耳炎及子宫睾丸炎等症状的病例较多,而以败血症为特征的急性死亡病例在临床实践中并不多见。3.2分离菌sd-1的耐药鉴定药敏试验结果显示,sd-1株对替米考星(T)、恩诺沙星(ENO)、氟苯尼考(F)、庆大霉素(GM)、头孢噻呋钠(CF)、阿莫西林(AMX)、环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、磷霉素(FOS)敏感;对硫酸新霉素(N)中度敏感,也说明了分离菌sd-1株对多种药物很敏感,应用大部分药物可有效控制。但此次发病,单独药物控制难以完全有效控制。孙宝莹等(2004)报道兔巴氏杆菌耐药现象较严重,多数为多重耐药,且对青霉素类、氟苯尼考及利福平敏感性较高,建议应用氟苯尼考治疗,但敏感药物临床应用是否会引发其他有害副作用,并未提及。笔者在临床实践中使用广谱抗菌药物,如利福平、氟苯尼考等,常会引发家兔腹泻等症状,从而引起家兔大批死亡的病例并不少见,因此,建议在家兔临床中慎用广谱抗菌药物,必须要用时,最好通过肌肉或静脉给药,防止发生意外。3.3试验结果及分析试验A和C组的死淘率分别为1.6%、1.0%,B组的死淘率为2.4%,都明显低于对照组的死淘率4.4%,说明3种防控方法均有疗效,其中以试验C组为最好,即巴氏杆菌本场疫苗免疫和恩诺沙星联用试验组。试验B组明显不如试验A、C组,试验B组用完药物30d后,新的疫情又开始了,又恢复到原来的状态。而试验A、C组一直保持低肺炎死亡率状态,在免疫30d后死亡的兔子肺脏中未再次分离到巴氏杆菌,说明应用巴氏杆菌本场疫苗能有效控制荚膜血清A型巴氏杆菌病。通过防治试验发现无论用疫苗免疫还是用恩诺沙星投药,刚开始采取措施之后10d内死亡率没有很明显的起色,随着日期的延长,死亡率进一步下降,笔者认为,这种现象可能是因为很多表面健康兔已经发病且陷入严重肺炎状态,但未观察到临床症状,随着时间延长,症状加重而死亡。而之后死亡率降低可能是恩诺沙星起到了前期杀灭细菌,抑制了细菌的增殖。巴氏杆菌本场疫苗免疫组则是前期抗体未达到相当高的滴度,尚