工业微生物育种学4

本节内容第五章工业微生物育种诱变剂第一节物理诱变剂第二节化学诱变剂第五章

工业微生物育种诱变剂诱变剂凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变的物理因子或化学物质，称为诱变剂。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。不同的诱变剂诱发的突变体的功能类型是不同的。最早的诱变剂是1927年用X射线诱发果蝇遗传性状变异时发现的。第一节物理诱变剂21世纪是生物学的世纪生物学在21世纪进入了一个飞速发展的时期，而且它还带动了其他学科的进步。生物学和其他学科间形成了很多的交叉学科。在物理学方面有生物物理学、生物力学、放射生物学、生物材料学等等。紫外线X射线γ射线快中子α射线β射线激光微波等离子可见光红外线物理诱变剂的实质事实上，物理诱变剂都是以量子为单位的可以发射能量的射线。我们把生物体或者其他实体放在各种射线下接受照射的过程称为辐射。根据辐射对物质基本结构的影响，可将它们分成非电离辐射和电离辐射。非电离辐射射线在穿过物质时，使该物质的分子或原子中的内层电子提高能级，但并不得到或丢失电子，因此不产生离子，故称为非电离辐射。如紫外线电离辐射一些高能射线在照射并穿过物质的过程中，能把该物质分子或原子上的电子击中而产生正离子，故称电离辐射。产生的正离子数量随着射线发射的能量增高而增加。如X射线、γ射线和快中子等。快中子有点特别。它本身是不带电荷的粒子，不直接产生电离，但是它可使吸收中子物质的原子核被撞击出质子。一、辐射引起生物变异的原因和生物效应由辐射引起生物的基因突变不是一个简单的过程。其作用过程通常分为物理、物理-化学、化学和生物等几个阶段。当辐射线处理生物细胞时，细胞首先接受辐射能量，穿过细胞壁、膜、质，最后与DNA接触，产生一系列的化学反应，从而有可能使DNA发生以下一些变化。辐射引起的DNA变化紫外线使DNA链上的两个嘧啶碱基形成嘧啶二聚体。DNA链断裂，有时是单链，有时是双链，在有关酶的作用下，可能使DNA重新排列组合。嘧啶碱基或嘌呤碱基被氧化脱氨基作用。碱基分子结构中碳与碳之间的链断裂形成开环现象。一个核苷酸被辐射能击中后使碱基或磷酸酯游离出来。在DNA分子的一条单链碱基之间或两条链的碱基之间发生交联作用。关于辐射引起的生物效应辐射引起的生物效应与射线种类和微生物的种类有关。同一种射线对不同的微生物其效应也不一样，这与每种微生物修复系统的强弱不同有关。电离辐射主要引起DNA上的基因突变和染色体畸变；非电离辐射主要是形成嘧啶二聚体。物理诱变剂引起微生物的变异或死亡与辐射剂量成正比。在相同的总辐射剂量的条件下，不管是一次连续照射和分次累加照射（间隔不能太久），也不管是高剂量短时间照射或低剂量长时间照射，其诱变效应基本上是相等的。切尔诺贝利核爆炸2011年3月11日爆发的9.0级特大地震影响，日本福岛核电站反应堆发生氢气爆炸二、辐射效应的影响因子内在因素：1微生物细胞壁结构2遗传类型3修复系统的强弱环境因素：1氧气有氧比缺氧时的电离辐射效应更好2温度较高的温度能促进氧气与自由基之间的作用,使射线与DNA接触过程所引起的化学反应加速3水分含水量影响细胞对辐射的敏感性4可见光能激活光复活酶的活性，分解紫外线引起的嘧啶二聚体三、非电离辐射——紫外线紫外线波长范围是40nm~390nm。紫外线可由紫外灯管产生。要求的设备简单、操作方便、价格低廉。紫外线诱变效果显著。诱变频率高，而且不易发生回复突变。因此紫外线是一种使用最早也是沿用最久的应用效果最明显的物理诱变剂。紫外线的诱变作用DNA分子能吸收紫外线光谱。其中嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感上百倍。紫外线使DNA分子发生如下几种变化：①DNA与蛋白质交联；②胞嘧啶和尿嘧啶之间的水合作用；③DNA链的断裂；④形成嘧啶二聚体。这是紫外线引起的主要变化。胸腺嘧啶和胸腺嘧啶二聚体单链和双链上形成的

胸腺嘧啶二聚体单链上的二聚体会影响到复制时的碱基正常配对。双链上的二聚体会阻碍双链的分开，复制到这一点就无法继续进行，造成DNA链的异常。紫外线诱变的自我修复实验显示：光复活酶在可见光存在的条件下可将DNA上的90%二聚体解聚。各种微生物产生光复活作用是不同的，而且导致各种微生物光复活的可见光谱范围也不一样。嘧啶二聚体可由光修复完成，其他DNA结构的变化，如交联，水合作用及DNA链断裂等，可由切除修复和重组修复等在暗处进行。紫外线的有效光谱紫外线的光谱范围是40nm~390nm，不过其有效诱导微生物发生突变的波长范围是200nm~300nm，最有效的波长为253．7nm。因为DNA可以吸收的紫外线光谱通常为260nm。这是DNA的特征吸收峰。DNA吸收最好的也就是诱变效果最好的。紫外线照射剂量的表示方法绝对剂量：用尔格/平方毫米表示，需要用一种剂量仪来测定，由于操作比较困难，实际工作中应用较少。紫外线照射剂量的表示方法相对剂量：用照射时间表示，剂量与照射时间成正比关系，照射时间长，剂量就大，只要控制好时间就可控制剂量。另外，还可用杀菌率来表示，专家认为它比用照射时间作为剂量单位更准确，它可以消除灯管不同或者灯管使用年代长短所造成的有效波长发射率不同的误差。紫外线照射剂量和杀菌率在一定范围内是成正比的，其在残存细胞中的变异幅度也有关系。杀菌率和诱变效果照射剂量越高，杀菌率也越高，在残存细胞中的变异幅度也广。一般认为杀菌率以90%~99%效果较好。但也有报道说，较低的杀菌率（70%~80%）有利于正突变型的产生。因此我们要设法掌握好减少死亡率和提高诱变效果之间的矛盾。紫外线诱变的步骤和方法1斜面培养出发菌株把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。

紫外线诱变的步骤和方法2前培养细菌的前培养以肉汤为主，适量加入核酸类物质或酵母浸膏等制成的营养丰富的培养基，同时还应加入抑制修复物质，如前面说的咖啡碱或异烟肼等。当接入的菌体培养到最佳生理状态时，16~24小时。霉菌、放线菌培养到绝大部分孢子刚刚萌发。紫外线诱变的步骤和方法3制备菌悬液离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，加入玻璃珠震荡分散，以无菌滤纸或脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达90~95%。要求菌悬液浓度：细菌约1×108个/毫升，放线菌107~108个/毫升，霉菌约106~107个/毫升。紫外线诱变的步骤和方法4紫外线照射取上述制备好的菌悬液5~6mL于直径9cm的平板上，并加入2cm长的磁力搅拌棒。先将紫外灯打开预热20min，以稳定光波。将盛有菌悬液的平板放到磁力搅拌器上，离灯管有一段距离，打开平皿盖，暴露在紫外线下照射一段时间。边搅拌边照射，力求使细胞均匀吸收紫外线光波。紫外线诱变的步骤和方法为了避免光修复，在照射的过程中要在暗室完成，仅可打开黄色或红色灯。另据国外报道，经过紫外线诱变后的菌体可以转入到无菌试管内，并立即浸入冰水中1~2h，在低温的条件下，细胞内参与突变修复的各种酶类的活性受到抑制，使修复难以进行。紫外线诱变的步骤和方法5后培养照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5~2h。有些微生物在此阶段还可加入酪素水解物、色氨酸或异烟肼等物质来抑制修复。本阶段利用延迟现象的原理，使诱变后的微生物生长更有利于突变体的繁殖和减少细胞悬液在储存过程中的死亡，并明显提高突变率。紫外线诱变的步骤和方法6稀释涂皿取一定量后培养物，作不同程度的稀释，根据培养物中的含菌量选择稀释倍数和体积，加到准备好的平板上，进行涂板培养和筛选。紫外线诱变的步骤和方法1斜面培养出发菌株2前培养3制备菌悬液4紫外线照射5后培养6稀释涂皿四、电离辐射常用的微生物诱变电离辐射物理诱变剂波长生物学效应X射线0.06~136nm1脱氧核糖的降解2糖-磷酸骨架的断裂3丧失嘌呤4碱基的羟基化5自由基和DNA分子反应6DNA链的断裂γ射线0.006~1.4nm快中子X射线和γ射线X射线和γ