第三章上DNA复制+++1

第三章：遗传信息的复制中心法则

(TheCentralDogma)转录翻译逆转录DNARNA蛋白质复制有丝分裂细胞周期（cellcycle）G1期S期间期（interphase）

细胞周期G2期前期(prophase)M期中期(metaphase)

后期(anaphase)

末期(telophase)

为什么还要学习DNA的复制?1,详细探究DNA复制的分子机制对认识生命现象有重要的意义人类的寿命,疾病…….2,基于复制原理发展的生物技术在工农业上均发挥着重要的作用.内容提要：●DNA的半保留复制●与DNA复制有关的物质●DNA的复制过程（大肠杆菌为例）●DNA复制的其它方式●真核生物中DNA的复制特点●基于复制原理的PCR技术DNA复制

第一部分DNA半保留复制DNA双螺旋结构的发现奠定了分子生物学的基础DNA的复制

由Watson-Crick模型预言的DNA复制是半保留式的。半保留复制（semiconservativeReplication）：每个子代DNA分子含有一条旧链和一条新链。半保留复制SemiconservativeReplication每个子代DNA分子含有一条旧链和一条新链。DNA的复制□DNA是遗传物质，作为遗传物质的首要条件是必须能自我复制。□Watson和Crick阐明的DNA模型预示了DNA具有复制的能力，通过氢键配对的方式复制新链。□曾设想有三种复制方式：（1）半保留式；（2）保留式；（3）分散式。(1)+(2)+(3)+曾设想有三种复制方式：保留式，半保留式，分散式1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。DNA的半保留复制2、实验证据（1958Messelson和Stahl）：

MatthewMesselsonFranklinStahl1930.05.241929.10.08PhotographtakenbyF.L.HolmesofMattMeselsonandFrankStahlin1996,standingatthesitewheretheymetatWoodsHole42yearsearlier.Meselson-stahl实验1958年，Meselson等证明DNA的复制是半保留式的。1．氯化铯超离心技术的原理DNA在CsCl溶液中经超速离心后，最终停留在某一位置上，这时离心力的大小正好等于DNA分子在CsCl梯度中的浮力。DNA的浮力是由其密度决定的。根据离心后DNA在梯度中达到的平衡位置的不同可以将不同密度的DNA分子分开，例如：15NDNA和14NDNA。2．将E.coli培养在含有“重”同位素15N的培养基中，经多个世代后，细胞中DNA就标记上“重”同位素。然后将细胞转到14N培养基中，经过一个或两个细胞分裂周期后，分离DNA，再进行CsCl离心。3.结果：经一个世代后，DNA形成了一条中间密度带。其位于“重”带和“轻”带之间。经两个世代培养后，DNA形成两条带，一条中间带，一条轻带。更直接的证据是将在14N中生长一代的细胞DNA（15N14N）变性后离心，可以得到一条重带和一条轻带。说明第一代杂种分子是半保留复制的产物。双链中一条是亲代15N，另一条是新合成14N，DNA为15N14N。Meselson-stahl实验TheMeselson-Stahlexperiment

Meselson-stahl实验结果的解释将H3-胸苷标记大肠杆菌DNA,然后用溶菌酶把细胞臂消化掉,使完整的DNA释放出来,铺在透析膜上,通过放射自显影的方法观察DNA复制的状态,黑点的浓度和轨迹代表了DNA分子的密度和形状.Cairns复制-大肠杆菌复制的直接证据DNA复制的机制其核心在于：DNA双螺旋中的两条链都携带相同的信息，其碱基对是互补的；因此，在复制过程中两条亲代链分离，分别作为模板引导酶催化的新生互补子链的合成，并遵循标准的碱基配对原则，两条新生双链在细胞分裂时分别进入两个子细胞；DNA复制的复杂性1,DNA分子复制中的几何学问题2,双螺旋链的解开?3,一种酶仅能催化有限的化学反应4,复制过程中的错误的纠正?5,不同生物DNA复制的方式及过程?

第二部分与DNA复制有关的物质(一)引子:DNA分子复制中的几何学问题基因组超螺旋电镜结构显示，就整体而言，大肠杆菌的基因组是由大量超螺旋的结构域构成的原核生物基因组结构6.8:140:11000:18000:1DNAdoublehelixNucleosome(10nmfiber)30nmFiberLoopsILoopsIIchromosomeDNA分子复制过程的几何学线状DNA形成的超螺旋环状DNA形成的超螺旋DNA扭曲与双螺旋相同（拧紧）DNA扭曲与双螺旋相反（松开）负超螺旋松弛DNA正超螺旋大多数天然DNA都具有负超螺旋,在复制的开始阶段可以缓解由于DNA复制而造成的超缠现象,当原有的负超螺旋用完时(5%),就需要引入新的负超螺旋,以缓解复制的阻力.拓扑异构体及拓扑异构酶拓扑异构体：给定连接数的DNA分子。拓扑异构酶：I型和II型、DNA促旋酶（ATP）。

ActionofatypeItopoisomerase.

ActionofatypeIItopoisomerase.

每一次反应可以引入两个负超螺旋（二）与DNA复制有关的物质1、原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。5、DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶●以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物●反应需要有模板的指导●反应需要有3

-OH存在●DNA链的合成方向为5

3

DNA聚合酶的分类原核生物的DNA聚合酶：DNA-polⅠ（1958，ArthurKornberg）DNA-polⅡ(1971,ThomasKornberg）DNA-polⅢ(1972,ThomasKornberg）HewasthefirsttoidentifytheenzymecatalyzingthesynthesisofDNA,polymeraseI.InrecognitionoftheirworkelucidatingthebasicmechanismsofDNAreplication,theywereawardedtheNobelPrizein1959.ArthurKornberg(1918-2007)HisfatherisArthurKornberg(1918-2007),winnerofthe1959NobelPrizeinMedicine,andhisolderbrotherisRogerD.Kornberg(born1947),winnerofthe2006NobelPrizeinChemistry.科恩伯格的长子罗杰·科恩伯格子承父业，也在基因研究领域取得卓越成绩。2006年12月，罗杰·科恩伯格凭借在“真核转录的分子基础”研究领域的贡献，独享诺贝尔化学奖。ThomasKornbergborn1948——对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段

/

Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性常用工具酶N端C端木瓜蛋白酶DNA聚合酶Ⅰ的功能

1.5‘→3’聚合功能2.3‘→5’外切活性3.5‘→3’外切活性(1)切口平移（nicktranslation）；(2)链的置换；(3)模板转换（template-switching）4.内切酶活性核酸必须有5’磷酸末端,且已经正确配对,以一个接一个的方式去除,可以是DNA,也可以是RNA.——在复制延长过程中

真正催化新链核苷酸聚合的酶DNA-polⅢ性质聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性+++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生链合成--+主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。修复紫外光引起的DNA损伤DNA复制的主要聚合酶，还具有3’-5’外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。

但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来

DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用3‘5‘3‘5‘OHP7、DNA拓扑异构酶(DNATopisomerase)：拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。

例：大肠杆菌中的ε蛋白拓扑异构酶Π：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。例：大肠杆菌中的DNA旋转酶8、DNA解螺旋酶/解链酶（DNAhelicase)

通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。rep蛋白沿3’

5’移动，而解螺旋酶I、II、III沿5’

3’移动。9、单链结合蛋白(SSBP-single-strandbindingprotein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。第三部分:DNA的复制过程（大肠杆菌为例）双链的解开RNA引物的合成DNA链的延伸切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段DNA的复制有特定的起始位点，常包含富含A、T的区段叫做复制原点。

复制原点常用ori(或o）表示。基本概念：复制起始区的结构特点：（1）富含A－T的3个13bp的串联重复序列，这可能和双链易于解开起始复制有关；（2）具有4个9bp的反向重复顺序，作为蛋白结合位点；1、复制起始点（E.coli-oriC:245bp）GATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATTACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866