第八章 色谱分析法导论 吴丽荣

第八章色谱分析法导论学习目标理解色谱分离的基本原理，了解色谱的分类方法掌握色谱流出曲线所代表的各种技术参数的准确含义掌握色谱分离的理论基础：塔板理论和速率理论方程学会各种色谱定性和定量的分析方法主要内容§8-1色谱分析法及其基本概念§8-2色谱分析法基本理论§8-3色谱分析法定性和定量分析方法§8-1色谱分析法及其基本概念一、色谱分析法的产生和发展二、色谱分析法分类三、色谱图及常用术语一、色谱分析法的产生和发展一、色谱分析法的产生和发展柱内的填充物称为固定相s

——（固体或液体）沿柱流动的物质称为流动相m——（气体或液体）装有固定相的柱子称为色谱柱

色谱法：根据混合物各组分在固定相和流动相中的选择性分配的差异，使各组分在色谱柱中的迁移速率不同而获得分离的方法。色谱法的发展史20世纪40年代：薄层色谱法TLC与纸色谱法PC50年代：气相色谱法GC60年代：高效液相色谱法HPLC，薄层扫描仪80年代初：超临界流体色谱法SFC80年代末：毛细管电泳法CE当前：色谱-光谱(或质谱)联用二、色谱法的分类2.1按两相的状态分类

流动相

固定相气-固色谱（GSC）气-液色谱（GLC）气相色谱气体液体液体固体1.气体为流动相的色谱称气相色谱法（

GC）2.液体为流动相的色谱称液相色谱法(LC）液相色谱液-固色谱（LSC）液-液色谱（LLC）扩展：超临界流体色谱法(SFC)

超临界流体是一种物质状态，当物质在超过临界温度及临界压力以上，气体与液体的性质会趋近于类似，最后会达成一个均匀相之流体现象。它具有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特征。SFC是GC和LC的补充，SFC可以解决气液色谱分析的难题，它可以分析气相色谱难汽化的不挥发性样品，同时具有比高效液相色谱更高的效率，分析时间更短。二、色谱法的分类2.2按分离机理分类吸附色谱：吸附剂对不同组分的吸附能力不同；分配色谱：不同组分在两相中的溶解度不同；离子交换色谱：不同组分与离子交换剂的交换能

力不同；凝胶色谱（分子排阻色谱）:凝胶对不同分子的阻滞作用不同。

视频《凝胶色谱法》二、色谱法的分类

2.3按操作形式分类1.固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。

比如GC、HPLC、CE、SFC

视频《柱色谱分离操作》2.固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，又分为薄层色谱、纸色谱、薄膜色谱。

视频《红蓝墨水的纸层析》小结色谱法的分类？小结色谱法的分类色谱法LLC分离机理液相色谱法吸附色谱法分子排阻色谱法两相状态分配色谱法LSC操作形式气相色谱法GSCGLC离子交换色谱法纸色谱法柱色谱法薄层色谱法薄膜色谱法平板色谱法三、色谱图及常用术语（一）色谱图（产生过程演示）色谱图：指检测器的响应信号随时间变化的曲线（浓度-时间曲线）色谱图产生过程（二）基本术语1.基线2.色谱峰3.保留值—定性依据死时间t0

；保留时间tR

；调整保留时间t'R

死体积V0

；保留体积VR

；调整保留体积V'R

基线1.基线：色谱柱后仅有流动相通过时，检测器响应信号的记录值。

稳定的基线是一条平行于横轴的直线。基线反映仪器是否稳定若基线上下波动称为噪声若基线上斜或下斜称为漂移2.色谱峰

组分流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化形成的峰形曲线，正常的色谱峰为对称的正态分布曲线。

峰高h=AB'区域宽度——评价柱效①标准偏差σ=EF/2②峰宽W=4σ=IJ

③半峰宽W1/2=2.354σ=GH/2

峰面积A——定量依据3.保留值——定性分析的依据死时间t0不与固定相作用的组分（如空气）从进样到出现峰最大值所需要的时间为死时间，亦即流动相到达检测器所需的时间。保留时间tR：组分从进样到出现峰最大值所需的时间组分从进样开始到色谱峰顶点对应的时间间隔称为该组分的保留时间。当操作条件不变时，组分的tR为定值，因此保留时间是色谱法的基本定性参数。调整保留时间t'R即t‘R=tR-t0。调整保留时间t'R体现的是组分在柱中被吸附或溶解的真实时间。因其扣除了与组分性质无关的t0，所以作为定性指标比保留时间tR更合理。死体积V0不能被固定相滞留的组分从进样到出现峰最大值所消耗的流动相的体积。亦即从进样器到检测器的流路中未被固定相占有的空隙的总体积。V0=t0×F0(F0为载气流速,单位：mL/min)死时间相当于载气充满死体积所需的时间。死体积大，色谱峰扩张(展宽)，柱效降低。保留体积VR是指组分从进样开始到出现峰最大值时所需流动相的体积。VR=tR·F0

(F0为载气流速)调整保留体积V'R

V'R=t'R·F0它真实地反应将待测组分从固定相中携带出柱子所需流动相体积。t'R和V'R——定性参数。总结：利用色谱图可以解决下列问题：（1）样品中所含组分的最少个数（2）保留值---定性（3）色谱峰面积（或峰高）---定量（4）色谱峰的区域宽度---评价柱效4.分配系数K和分配比k'4.1分配系数K在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数（平衡常数），用K表示，即：组分在固定相中的浓度组分在流动相中的浓度K=

cS

cm=K与柱温有关，与两相体积无关。

分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，保留值越?，出峰越?；若两组分的K值相等，则同时出峰各组分的K值不同是分离的基础；某组分不被固定相保留，则K=?组分在固定相中的浓度组分在流动相中的浓度K=

cScm=（大,慢）（0）4.2容量因子(k’)——分配比

在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量之比，称为分配比（容量因子、容量比）补充：tR、VR与K、k'的关系操作条件一定时，K或k'越大，保留值越大若K或k'相等，则两组分的色谱峰重合K或k'不等是色谱分离的先决条件§8-2色谱分析法基本理论一、塔板理论二、速率理论三、色谱分离总效能的衡量一、塔板理论

分馏的原理是通过加热，从塔底形成的上升蒸气流和从塔顶冷凝的下降液体流（回流），在塔板液层上进行气液两相的热交换和质交换，依据组分的挥发度不同，轻组分随蒸气流向上，重组分随液体流向下，从而完成液体混合物的分离目的。一、塔板理论

该理论是把色谱柱比作一个分馏塔，从而把色谱分离过程比作分馏过程。色谱柱内有很多层分隔的塔板，在每一层塔板上，组分可达到一次分配平衡。因被分离组分的分配系数不同，经多次分配平衡后，K小的组分先流出色谱柱。只要色谱柱的塔板足够多，组分的K值仅有微小的差别，也可得到较好的分离。色谱柱长：L虚拟的每次分配平衡所需的塔板高度：H色谱柱的理论塔板数：n则三者的关系为：n=L/H理论塔板数的计算公式：注意：单位统一！有效塔板数(neff)和有效塔板高度(Heff)

n或neff、H或Heff——描述柱效能的重要指标对于单一组分，n或neff越大（H或Heff越小），柱效能越高，色谱峰越窄。注意：单位统一！练习1在一根长3m的色谱柱上分离一样品，得下列数据：空气、组分1及组分2的保留时间分别为1、14、17min，组分2的峰宽为1min。求：（1）组分1和组分2的调整保留时间；（2）用组分2计算该色谱柱的理论塔板数、理论塔板高度。（3）用组分2计算该色谱柱的有效塔板数、有效塔板高度。练习2在长为2m的阿皮松柱，柱温为100℃，记录纸速为2.0cm/min的实验条件下，测得苯的保留时间为1.5min，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数和理论塔板高度。解：在实验中，如何比较不同色谱柱的柱效？在相同的实验操作条件下，用同一物质通过不同色谱柱，根据所得的色谱峰分别计算出neff

,neff越大，则柱效能越高思考：某人制备了一根色谱柱，用组分Ａ，Ｂ为测试样测得该柱的理论塔板数为４５００和４０００，因而推断Ａ和Ｂ组分在该柱上一定能得到很好的分离，该推断正确吗？思考：答：不正确。因为塔板数n多，只能说明柱效高，色谱峰窄；不能判断二组分是否能被分离塔板理论的特点和不足：特点：塔板理论有助于我们了解色谱分离的过程以及柱效的评价。不足：它的某些假设与实际色谱仪过程不符；无法提出提高柱效的途径。二、速率理论范第姆特方程式:式中H为理论塔板高度；u为流动相的线速度(cm/s)；A为涡流扩散项；B/u为分子扩散项；C·u为传质阻力项其中dp表示固定相的平均粒径大小；

λ为填充不规则因子固定相颗粒越小（dp）越小，填充的越均匀，柱效n越高

因分子运动路径不同，导致同分子出柱时间不同：分子扩散项（纵向扩散项）：B/u组分在气相中的扩散比在液相中的扩散严重的多，分子扩散项主要针对GCD为组分在流动相中扩散系数（cm2·s-1）

D=Dl+Dg≈Dg

减小的方法：①采用较高的载气流速②选择分子量大的重载气（N2）③采用较低柱温分子扩散与组分在柱中的停留时间有关，停留时间越长（u小），分子扩散越严重。因此，当线速度u大时，B/u项可忽略。3.传质阻抗项：C·u减小CL的方法：降低固定液膜厚度；提高柱温

C=Cg+CL

Cg—气相传质阻力系数；CL—液相传质阻力系数减小Cg的方法：采用粒度小的填充物；分子量小的气体（如H2）作载气解释柱填充均匀程度、固定相粒度、流动相种类、流动相流速、柱温、固定液层厚度等对柱效的影响。热力学：塔板理论解释色谱峰形状、定义柱效的评价指标动力学：速率理论——VanDeemter方程

两个基本理论三、色谱分离总效能的衡量1、柱效能和选择性2、分离度

R

3、分离度与柱效、选择性的关系1、柱效能和选择性柱效能：是指色谱柱在分离过程中的分离效能。对于单一组分：n（或n

有效）越大，柱效能越好。选择性：常用色谱图上两峰间的距离衡量色谱柱的选择性，峰间距越大说明柱子的选择性越好。一般用相对保留值表示:相对保留值仅与柱温、固定相性质有关，是比较理想的定性指标。比较下列色谱分离情况的柱效和选择性高低①柱效低，选择性低②柱效高，选择性低③柱效低；选择性高④柱效高，选择性好R<1.0：两峰部分重叠；R=1.0：分离程度98%，基本分离；R≥1.5：分离程度达99.8%，完全分离。2.分离度R——总分离效能指标R=1.5是相邻两峰完全分离的标志。注意：保留时间与峰宽应取相同单位R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志3、分离度与柱效、选择性的关系可以通过增加塔板数n、增加选择性r2,1、分配比k'提高分离度。设法降低板高，提