第7章 RNA遗传 - 副本

分子遗传学

MolecularGenetics

第7章RNA遗传

中国医科大学

医学遗传学教研室

李福才

2013.3

1第7章RNA遗传

7.1RNA世界——生命早期的遗传物质

7.2RNA干涉/干扰现象

7.3RNAi对基因表达的作用

7.4RNA编辑RNA遗传在中心法则中，RNA只是作为一个中间环节被描述，真正的遗传模板是DNA。但是，20世纪70年代发现反转录酶以后，在Crick修正后的中心法则中，可以看到RNA已不是过去的中间环节，而是具有与DNA同等地位的遗传模板。

然而，RNA编辑、RNA干扰的发现与研究，更使我们对RNA的遗传作用刮目相看。

著名的分子生物学家Pennisi指出：“基因占据生物学的舞台已经数十年。但最近的工作提出，虽然基因经常是挂牌的名角，可它们更像一些木偶。各种蛋白质，有时是RNAs，在拉着线，告诉基因在何时何地打开或关闭”。7.1RNA世界——生命早期的遗传物质

RNA世界假说认为，在生命进化早期没有蛋白酶，某些RNA序列可以催化RNA的复制。也就是说，RNA是生命早期的唯一遗传物质，它是生命的源头。

在RNA遗传的基础上，才有了后来的DNA与蛋白质体系。事实上，RNA的遗传作用并未在生命的进化中消失，在一定程度，RNA仍在支配着DNA与蛋白质的命运。

Johnston等的工作证明，某种RNA分子确实能够催化RNA复制中的多聚化。

应用NTP及RNA模板的编码信息，使RNA引物持续增加14个核苷酸长度，等于RNA螺旋一圈。这种多聚化是RNA模板依赖的，是按照引物的序列、长度，以及RNA模板的信息进行的。证明了引物的3′是在与RNA模板逐一地、严格地配对的情况下进行的。结果，多聚化过程是逼真的；在引物被扩展11个核苷酸的情况下，对此等序列进行了克隆和序列分析，在1100个样品中有1088个是与模板标准匹配的。如表7.1

Bartel等使用存在于随机RNA序列的备用池中的RNA-连接酶ribozymes衍生物。某些衍生物能够使用NTP及RNA模板的部分区域进行模板指导的引物延伸。这些连接酶衍生物通过与模板的不配对的以特异小段的杂交来识别并催化该引物---模板复合体的RNA复制。从使用的模板的一小段来指导引物延伸来看，这些ribozymes不像复制RNA/DNA的酶的多聚化反应，更类似于末端酶。从上述可知，W.K.Johnston等所描述的RNA复制虽然效率不高，却是真正的RNA自我复制。因为它不像DNA复制那样，需要许多蛋白酶来进行加工。而这里的RNA复制，它不需要任何蛋白质，完全由RNA酶(ribozymes)及RNA模板完成。

而通常的DNA/RNA病毒的复制以及细胞DNA复制都不是由纯粹的DNA或RNA系统完成的。因此，RNA无疑地是一种复制模板。图7.3RNA复制实验7.2RNA干涉/扰7.2.1RNAi的分子机制RNA对基因表达的调控称为RNA干扰（RNAinterference,RNAi）。

RNAi是一种转录后的基因沉默现象（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）,是dsRNA触发细胞质中与其同源的mRNA的降解，或在细胞核中dsRNA诱导同源的DNA的后生修饰（甲基化）而导致转录水平上的沉默。

RNA沉默是一种阻遏外来序列的有效手段，并在动、植物发育中有重要作用。

1998年FireA.和MelloC.C在线虫中发现RNAi现象。获得2006年Nobel医学和生理学奖。RNAi作用机制：

在不同的生物中，不同来源的双链RNA(dsRNA，约500bp)被DICER（含有螺旋酶，helicase，dsRNA结合域，及PAZ功能域）裂解为一种具特异序列的有活性中间体---21~23nt的双链siRNA（smallinterferingRNAs或guideRNAs）。

然后，siRNA结合核酸酶复合物（RISC的蛋白质部分）形成RNA诱导复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活的RISC依靠siRNA中的一条链（GuideStrand）去寻找互补的mRNA链，然后RISC中的核酸内切酶（Augonate2,Ago2）在距离siRNA3＇端12bp的位置切割mRNA。

RNAi的分子遗传机制

基因mut-7及rde-2如果发生突变则导致内源转座子在生殖细胞中动员，称之为増变现象。说明RNAi过程是造成转位子抑制的原因。如果基因rde-1和rde-4发生突变，则对线虫注射dsRNA后缺乏产生RNAi的响应，在生殖细胞中也不能动员转位子。dsRNA被转换为特异序列中间体（R）,然后引起同源的mRNA降解/沉默。rde-1及rde-4为从dsRNA产生R所需要，mut-7及rde-2则被需要来响应R使靶mRNA沉默。7.2.2siRNA的产生与扩增

在线虫中，小量的dsRNA能够作用于大量的靶mRNA。这是因为dsRNA在转变为siRNA的过程中，至少有三种扩增途径。

1）Dicer酶可以把长的dsRNA截成10~20段，等于扩增10~20倍。2）存在一种催化机制，siRNA常常成倍增加，以用于进一步扩增。3）短的RNAs能作为靶mRNA的引物，在RNA依赖的RNA多聚酶的作用下，启动一个RNA指导的RNA多聚化反应，随后产生许多“次级siRNAs，称为靶指导的扩增。（图7.7）

首先dsRNA被切成短的siRNA,使dsRNA转换成ssRNA。这些单链正常的siRNA如果没有识别同源的靶mRAN，并与之配对，就会被降解。

一旦反义的siRNA与靶mRNA配对，则靶-指导的siRNA的扩增就会发生。这时，与靶mRNA配对的siRNA小段将沿mRNA延伸，但只能延伸几百个碱基左右就停止，并从该区裂解下来而成为次级siRNA。这种效应称之为“可迁移效应”。

siRNA与靶mRNA的稳定化与“可迁移效应”的结合就形成了一个“连式反应”，在这个反应中，随着Dicer的作用，primersiRNA的更新，以及新的一轮扩增，将发生siRNA的多轮的复制。

应该注意到，这种复制或扩增并不是自我复制/扩增，而是从primerA产生primerB,primerC,primerD,…这是从一个局部延伸为全体，再从全体裂解为若干局部的过程。7.2.3RNAi的遗传

它们是一些专与某一基因特异结合的片段，而且在它们应该发挥作用的特异的时空中，含量相当丰富，暗示着它们也许能够复制。Grishok等在线虫中的实验证明，RNAi性状是后生的，可遗传。它不需要通过基因序列的改变-----突变。线虫（C.elegant）实验(图10)：

1）注射dsRNA;

2）把虫子泡在含有dsRNA溶液中；

3）或者喂以正在表达有义及反义RNA的微生物。将dsRNA注射到线虫两性体，在子一代（F1）产生的基因沉默（RNAi）往往在F2消失。但是，在母性生殖系中，由RNAi引起的基因抑制，可以偶尔地遗传到F2及以后各代中（图7.8）。

Grishok等证明，如果RNAi在母体启动，它可以通过F1的精子传到F2，尽管该精子缺乏RNAi的靶基因。所以，RNAi一旦启动，即使在缺乏内源靶基因的情况下,雄性生殖系细胞能够传递RNAi。

因此，RNAi性状是后生的，可遗传的。它并不需要通过基因序列的改变----突变。7.3RNAi对基因表达的作用7.3.1RNAi是对基因组的基因表达的反馈RNAi的发现使我们对RNA调控基因认识不断深入。这种小的RNAs分子根据它们的来源不同被称为siRNA（shortinterferingRNAs）miRNA(microRNAs)。它们借助于互补的mRNA的结合，触发mRNA降解或阻止mRNA翻译成蛋白质。近年来研究表明，RNAi的途径不仅限于作用于基因组或使mRNA沉默。

在裂殖酵母中，RNAi是装配着丝点和使配对区异染色质化所必需的。并发现常染色质可因RNAi的作用而形成异染色质。另外，他们还发现，在特异的沉默机制下，在有性周期中可使用分散的内源DNA重复序列来抑制基因。（7.9）

现在已经证明，RNA从基因组上转录下来后能够反馈回去修饰基因组。这些修饰作用可以通过细胞分裂遗传下去并影响发育过程。7.3.2RNAi引导的同源RNA降解在动物、植物及真菌等各种生物中引起转录后基因沉默（PTGS）/RNAi的机制都是大同小异，高度保守的。说明它的古老起源。

基本机制是dsRNA被加工成更小的片段（siRNA），对同源mRNA进行识别与裂解，以及诱导DNA的甲基化而导致PTGS/RNAi现象。dsRNA的产生有多种方式包括：

反向的DNA重复序列的转录；有义及反义RNA的同时合成；

病毒复制，细胞/病毒的RNA依赖的RNA多聚酶（cRdRP/vRdRP）对单链RNA模板的转录。（图7.11）PTGS/RNAi产生的机制可分二步：第一步是dsRNA内切酶的作用，把sRNA加工成21~25nt的有义和反义的RNA(siRNA)，这些siRNA首先在植物中发现。在果蝇中，它们是由一种称为Dicer的RNaseⅢ所产生。Dicer已在线虫、S.pombe及哺乳动物中发现，它含有螺旋酶（helicase）,dsRNA结合域，及PAZ结构域。第二步因Dicer所产生的siRNA引导RISC裂解同源的单链mRNAs。RISC恰在反义siRNA与mRNA结合区域的中间切割mRNA,使mRNA进一步降解。

虽然RISC的大多数蛋白成分还不清楚，但已知到它含有内切酶、外切酶、螺旋酶及同源搜索活性。RISC的成分是PAZ/Piwi蛋白。通过PAZ域与Dicer作用把siRNA吸收到RISC中。评论：PTGS/RNAi现象的本质是不能正确地表达基因产物对基因的反馈调控。既然该基因已不能表达信息，就应该使其沉默。这种沉默不是DNA本身的突变，而是后生的基因沉默。这种后生的DNA甲基化是遗传的。这是一种对基因表达环境的一种可遗传的适应。7.3.3RNAi引导的同源DNA修饰RNA引导的同源DNA序列的胞嘧啶的从头甲基化是首次在类病毒感染转基因植物中发现的。继之，又在非病原的植物系统中发现。

RNA指导的DNA甲基化如同降解同源RNA一样，需要把dsR